GLP-1對AGEs誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷的拮抗作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　建立糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）誘導的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)模型，探討GLP-1是否具有拮抗AGEs誘導的氧化應激從而保護血管內(nèi)皮細胞的作用，并探討GLP-1是否可通過NADPH-、PKA-eNOS信號途徑發(fā)揮抗氧化、抗凋亡及抗線粒體損傷的作用。
　　方法：
　　1.人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的分離、培養(yǎng)及鑒定。
　　標本均來源于廣東藥學院附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科正常足月妊娠新生兒臍帶經(jīng)消毒、

2、沖洗、0.1％的Ⅰ型膠原酶消化、收集等步驟得到分離的細胞。分離后接種細胞于培養(yǎng)瓶，置于37℃、5％二氧化碳(Carbon dioxide，CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長融合達80％以上時，進行消化傳代，取生長良好的第3代細胞用于鑒定。使用免疫熒光法檢測內(nèi)皮細胞的標志物第Ⅷ因子相關(guān)抗原(VonWillebrand factor，vWF)。
　　2.建立AGEs誘導的HUVECs氧化損傷模型，探討AGEs對內(nèi)皮細胞的損傷作用。

3、>　　牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)與D-葡萄糖溶于PBS中，避光孵育12周制備AGEs。熒光分光光度計鑒定AGEs。以同樣條件下不含糖的BSA溶液孵育12周后制備的溶液作為本實驗的陰性對照組。
　　實驗分為:空白對照組、AGEs(100、200、400、600、800 ug/mL)組，以上6組作用HUVECs24 h（該部分結(jié)果將確定AGEs作用濃度，之后本論文的AGEs及BSA濃度不再特別說明

4、，均采用該濃度）;以上確定作用濃度的AGEs分別作用HUVECs12、24、36、48 h，另設(shè)一空白對照組。每孔加入10μM二氯熒光黃雙乙酸鹽(Dichlorofluorescein diace-tate，DCFH-DA)，經(jīng)流式細胞儀檢測熒光強度。
　　確定BSA及AGEs作用濃度及時間后，實驗分為:空白組、BSA組、AGEs組。配置四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5，5'，6，6'-tetrachloro-1，1'，3，3

5、'-tetrethyl benzimidalyl carbocyanine iodide，JC-1)工作液后與HUVECs共孵育，經(jīng)流式細胞儀進行熒光檢測細胞線粒體膜電位的變化。按磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋V/碘化丙啶(AnnexinⅤ/Propidium iodide，AnnexinⅤ/PI)凋亡試劑盒說明書要求處理細胞后，經(jīng)流式細胞儀分析細胞凋亡。
　　3.煙酰胺腺嘌呤二核苷酸酸氧化酶4(Triphopyridine nucleoti

6、deoxidase4，NOX4)在GLP-1對AGEs誘導血管內(nèi)皮細胞中的作用。
　　空白對照組、BSA組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組，通過蛋白印跡法（Western Blotting法）檢測NOX4蛋白表達。GLP-1預處理細胞30 min后再加入AGEs，GLP-1濃度采用100 nM。（本課題前期研究顯示，該濃度下GLP-1可顯著抑制AGEs誘導的細胞凋亡。）（以下部分均按該順序操作，不再贅述。）

7、>　　空白對照組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（Reverse transcription PC，RT-PCR）檢測HUVECs的NOX4信使核糖核酸(Messenger RNA，mRNA)表達。
　　空白對照組、AGEs組、AGEs+陰性對照siRNA組、AGEs+ NOX4siRNA組，檢測NOX4表達抑制前后，HUVECs的細胞凋亡率、ROS及線粒體膜電位水平。采用lipo-20

8、00進行NOX4干擾性小核糖核酸(Small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染，陰性干擾組采用亂序的siRNA為錯配對照組，應用RT-PCR鑒定轉(zhuǎn)染結(jié)果。
　　4.蛋白激酶A-(Protein kinase A，PKA-)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶-(Endothelialnitric oxide synthase，eNOS-)在GLP-1對AGEs誘導血管內(nèi)皮細胞中的作用
　　空白對照組、BSA組、AGEs組、G

9、LP-1組、AGEs+GLP-1組分別檢測PKA蛋白表達。
　　空白對照組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組、AGEs+GLP-1+PKA抑制劑組，檢測細胞eNOS蛋白表達、ROS生成水平及細胞凋亡率
　　空白對照組、BSA組、AGEs組、GLP-1組、AGEs+GLP-1組、AGEs+GLP-1+eNOS抑制劑組，檢測細胞一氧化氮（Ntrogen monoxide，NO）生成水平及細胞凋亡率。
　　抑

10、制劑預處理細胞lh后，加入（或不加）GLP-1100 nM干預30 min，最后加AGEs。
　　5.統(tǒng)計學處理
　　數(shù)據(jù)采用SPSS17.0進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示，統(tǒng)計方法采用單向方差分析(One-Way ANOVA)，其中兩兩比較采用LSD法，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析法，P＜0.050為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1.充分掌握好消化時間，可得到純度較高的HUVE

11、Cs。
　　2.當AGEs作用濃度達400 ug/mL時，細胞ROS含量熒光值達到最大，當AGEs作用24 h后，細胞ROS含量熒光值達到最大。
　　3.GLP-1抑制AGEs誘導的血管內(nèi)皮細胞損傷。
　　與空白組相比，BSA不影響內(nèi)皮細胞ROS生成(P=0.996)，AGEs處理組較空白組ROS生成明顯增多(P=0.007)，而GLP-1與AGEs共孵育組較AGEs單獨處理組的ROS熒光強度明顯減弱（P=0.010）

12、。
　　對AGEs誘導的內(nèi)皮細胞凋亡及細胞線粒體膜電位下降，加入GLP-1后可顯著降低細胞凋亡率（P=0.000），升高線粒體膜電位(P=0.014)。
　　4.NOX4在GLP-1對AGEs誘導血管內(nèi)皮細胞中的作用。
　　AGEs促進內(nèi)皮細胞NOX4基因表達及其蛋白的合成，與空白對照組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義（P值分別為0.000和0.001）;在AGEs組加入GLP-1后，可顯著抑制內(nèi)皮細胞NOX4基因的表達及蛋白

13、合成，與AGEs組相比差異有顯著統(tǒng)計學意義（P值分別為0.000和0.003）。
　　在AGEs誘導下，抑制NOX4mRNA表達后，內(nèi)皮細胞ROS含量熒光值顯著降低，與單純AGEs處理組及AGEs+陰性干擾組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P值分別為0.011和0.010）。
　　干擾NOX4mRNA基因表達可顯著拮抗AGEs誘導的細胞凋亡及線粒體膜電位下降（P值分別為0.000和0.017），而予以非NOX4siRNA的小干擾處理

14、則不影響細胞凋亡率及線粒體膜電位（P值分別為0.169和0.741）。
　　5.PKA-在GLP-1對AGEs誘導血管內(nèi)皮細胞中的作用。
　　與空白對照組相比，BSA并不影響內(nèi)皮細胞PKA蛋白表達（P=0.186），而AGEs可誘導內(nèi)皮細胞的PKA蛋白表達顯著下調(diào)(P=0.003);與AGEs單獨處理組相比，加入GLP-1共孵育后，AGEs誘導的PKA蛋白較AGEs組顯著上調(diào)(P=0.003)。
　　AGEs組加入GL

15、P-1后，其ROS含量熒光值較單純AGEs組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.013); AGEs+GLP-1組加入PKA抑制劑H-89·2HCl后，細胞ROS含量較加入H-89·2HCl前升高(P=0.045)，即抑制PKA蛋白表達后可部分拮抗GLP-1對AGEs誘導內(nèi)皮細胞ROS生成的抑制作用。
　　GLP-1與AGEs共孵育組的細胞凋亡率顯著低于AGEs組(P=0.001);PKA抑制劑H-89·2HCl可顯著拮抗GLP-1對

16、AGEs誘導細胞凋亡的抑制作用(P=0.010)。
　　GLP-1與AGEs共孵育組的細胞線粒體膜電位顯著高于AGEs組(P=0.011);加入PKA抑制劑H-89·2HCl后，與AGEs+GLP-1組相比，細胞線粒體膜電位顯著降低(P=0.021)。
　　6.eNOS-在GLP-1對AGEs誘導血管內(nèi)皮細胞中的作用。
　　與空白組相比，AGEs可誘導內(nèi)皮細胞eNOS蛋白表達顯著下調(diào)(P=0.004);在AGEs中加入

17、GLP-1后，可使受抑制的eNOS蛋白表達再次上調(diào)(P=0.035);AGEs組予以H-89·2HCl干預后，AGEs對eNOS蛋白表達的抑制作用無明顯改變（P=0.908）;而AGEs+GLP-1組予以H-89·2HCl干預后，細胞eNOS蛋白表達受抑制（P=0.045）。
　　eNOS抑制劑L-NAME干預前，AGEs+GLP-1組較AGEs組NO水平顯著升高(P=0.017)，細胞凋亡率顯著降低(P=0.000)。L-NAM

18、E干預后，AGEs+GLP-1組NO生成明顯受抑制(P=0.017)，且細胞凋亡率增加(P=0.011)。
　　結(jié)論：
　　1.成功建立一種能大量分離HUVECs的體外培養(yǎng)方法。
　　2.GLP-1可通過抑制NOX4或激活PKA信號通道，拮抗AGEs誘導的HUVECs氧化應激及線粒體損傷，從而發(fā)揮內(nèi)皮細胞保護作用。
　　3.在AGEs誘導的HUVECs損傷中，GLP-1可通過PKA-eNOS-NO信號通道發(fā)揮保護