CⅡTA基因啟動子Ⅳ不同單倍型的初步功能研究及其與HBV感染不同轉(zhuǎn)歸的相關(guān)性分析.pdf

1、研究背景與目的： 乙型肝炎病毒感染的臨床表型復(fù)雜多樣，其形成機(jī)制尚未闡明。除了病毒因素外，宿主遺傳易感性是一個重要的方面。宿主感染HBV后，MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)水平直接影響宿主對HBV的免疫應(yīng)答。CⅡTA是調(diào)控細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ類分子及其水平的限速因子，通過調(diào)控細(xì)胞是否表達(dá)MHC-Ⅱ類分子及水平來決定宿主的免疫功能狀態(tài)，從而影響感染性疾病、自身免疫性疾病、移植排斥及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸。在HBv感染的遺傳易感性研究中，疾病的

2、關(guān)聯(lián)研究最常用。國外研究發(fā)現(xiàn)CⅡTA基因存在SNPs，并與自身免疫性疾病的易感性相關(guān)。我們前期研究發(fā)現(xiàn)中國人CⅡTA基因也存在SNPs，其中啟動子IV區(qū)有4個。我們選擇啟動子IV區(qū)等位基因頻率較高的2個SNP位點(diǎn)G-944C、T-1350C在HBV感染人群中進(jìn)行基因分型，探討CⅡTA啟動子IV區(qū)基因多態(tài)性是否與HBV感染不同臨床表型的形成有關(guān)，并對CⅡTA基因啟動子IV區(qū)不同單倍型進(jìn)行初步功能研究。 研究對象與方法： 在

3、1420例不同臨床表型的：HBV感染人群和125無HBV感染的正常健康獻(xiàn)血員中，采用四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)對CⅡTA啟動子Ⅳ區(qū)2個SNP位點(diǎn)G-944C和T-1350C進(jìn)行基因分型，分析每個位點(diǎn)及每種單倍型和基因型在HBV感染不同臨床表型人群中的分布頻率。然后選取經(jīng)四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR分型技術(shù)確定的CC/CC、CG/CG、TC/TC和TG/TG基因型患者各1例，分別提取其外周全血細(xì)胞DNA作模板，制備CⅡTA基因另外4

4、種單倍型DNA的部分片段，并構(gòu)建包含4種單倍型啟動子IV區(qū)DNA的螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體。將2種螢光素酶報(bào)告基因空載體和4種單倍型的表達(dá)載體分別與pRL-TK內(nèi)參質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測插入目的片段前后螢光素酶表達(dá)量的變化來反映不同單倍型DNA片段的功能。 主要研究結(jié)果： 一、CⅡTA基因啟動子Ⅳ多態(tài)性與HBV感染慢性化的關(guān)系 相對于自限性HBV感染人群，在HBV感染慢性化人群中T-1350C位點(diǎn)的T等位

5、基因和G-944C位點(diǎn)的G等位基因頻率較低，而T-1350C位點(diǎn)的C等位基因和G-944C位點(diǎn)的C等位基因在HBV感染慢性化人群中頻率顯著升高(X2=18.1，18.0；P=6.3×10-5,6.3×10-5).四種單倍型中，慢性HBV持續(xù)感染人群中CC單倍型頻率較急性自限性HBV感染者高，TG單倍型頻率較低(X2=17.3，P=7.9×10-5).非條件logistic回歸分析除去年齡和性別影響后發(fā)現(xiàn)，慢性HBV持續(xù)感染和自限性HBV

6、感染人群之間4組基因型頻率分布相差非常顯著(OR0.507；95％CI，0.401-0.642；p=6.9x10-8)，而且這種差異主要見于CC/CC與TG/TG基因型之間(OR0.503；95％CI，0.394-0.641；P=1.7×10-8)。與攜帶TG/TG基因型者相比，攜帶CC/CC基因型者感染HBV后更容易慢性化。健康獻(xiàn)血員的單倍型及基因型頻率介于慢性HBV感染人群和自限性HBV感染人群之間。 二、CⅡTA基因啟動子

7、Ⅳ多態(tài)性與慢性HBV感染者疾病表型間的關(guān)系 4種單倍型在慢性無癥狀HBV感染、慢性乙型肝炎及HBV感染相關(guān)性肝硬化人群中分布頻率彼此間存在顯著差異(P均小于0.001)；與慢性無癥狀HBV感染者相比(CC:46.5％：TG:32.9％；CG:15.9％)，肝硬化人群中CC單倍型頻率(35.3％)較低，CG(29.3％)與TG(34.0％)單倍型頻率較高，其中CG單倍型頻率升高更顯著；與慢性無癥狀HBV感染者相比，慢性乙型肝炎人群

8、中CC單倍型頻率(37.2％)較低，TG(42.2％)與CG(18.9％)單倍型頻率較高，其中TG單倍型頻率升高更顯著；與慢性乙型肝炎者(CC:37.2％；TG:42.2％；CG.18.9％)相比，肝硬化人群中CC(35.3％)與TG(34.0％)單倍型頻率較低，而CG(29.3％)單倍型頻率顯著升高(CG比CC:X2=8.274，df=1，P=0.004:CG比TG:X2=15.027，df=1，P=0.000)；兩組人群間CC與TG

9、單倍型頻率相差不顯著(X2=1.231，df=1，P=0.267)。慢性無癥狀HBV感染、慢乙肝、肝硬化三組人群彼此間各組基因型的頻率也均存在非常顯著差異(P=0.000)；其中含CG單倍型的基因型(CG/CG，CG/CC和CG/TG)在肝硬化人群中頻率最高(53.5％)。 三、CⅡTA啟動子IV不同單倍型DNA片段的功能研究 包含CⅡTA啟動子IV兩SNP位點(diǎn)的片段(-1382～-913nt)插入pGL3-basic載

10、體后轉(zhuǎn)染HepG2的細(xì)胞螢光素酶表達(dá)量與pGL3-Basic轉(zhuǎn)染HepG2后的細(xì)胞螢光素酶表達(dá)量之間無差異，提示CⅡTA-1350T/C和-944G/C位點(diǎn)所在的DNA片段(-1382～913nt)無啟動子活性。但pGL3-Promoter-CⅡTA-CC、pGL3-Promoter-CⅡTA-CG、pGL3-Promoter-CⅡTA-TC和pGL3-Promoter-CⅡTA-TG轉(zhuǎn)染HepG2后的細(xì)胞螢光素酶表達(dá)量，均顯著低于pG

11、L3-Promoter轉(zhuǎn)染HepG2后的細(xì)胞螢光素酶表達(dá)量，提示CⅡTA-1350T/C和-944G/C位點(diǎn)所在的DNA片段(-1382～-913nt)具有衰減子的功能。且四種單倍型間有顯著差異，TG的螢光素酶活性(0.558±0.023)顯著高于CG(0.464±0.016)、TC(0.463±0.015)、CC(0.302±0.016)單倍型。CG和TC單倍型高于CC單倍型(P=0.000)，但CG和TC單倍型間活性無顯著差異(P=

12、0.892)。 結(jié)論： 1.CⅡTA啟動子IV-1350C/T和-944G/C兩個SNP位點(diǎn)所在的DNA片斷(-1382～-913nt)無啟動子活性，但具有衰減子的功能，-1350C/T和-944G/C位點(diǎn)多態(tài)性可影響CⅡTA啟動子Ⅳ的活性。 2.CⅡTA啟動子Ⅳ的基因多態(tài)性與HBV感染的不同轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，其中活性最低的CC單倍型及CC/CC基因型與HBV感染的慢性化有關(guān)，活性最高的TG單倍型及TG/TG基因型與