轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的CPT-PAMAM-PEG.pdf

1、惡性腫瘤已經(jīng)成為威脅人類健康和生命的最主要疾病之一,其發(fā)病率每年新增近1千萬例。近幾年對腫瘤生理深入的探索,促進了腫瘤診斷和治療的發(fā)展,其死亡率有所下降。目前腫瘤的治療手段包括手術治療,放療和化療等,放化療在殺死腫瘤細胞的同時也能殺死正常細胞,給病人帶來嚴重的毒副作用。因此研制更有效地靶向腫瘤細胞的給藥系統(tǒng)顯得尤為迫切。被動靶向釋藥系統(tǒng)成功利用腫瘤的生理特征使載藥系統(tǒng)通過EPR效應在腫瘤部位蓄積。藥物聚合物納米載體系統(tǒng)由于其良好的可調(diào)控

2、性、易于表面修飾、較高的藥物包封率、較強的藥物保護作用和適于大規(guī)模生產(chǎn),已成為研究熱點之一。雖然被動靶向釋藥奠定了靶向給藥臨床治療的基礎,但仍存在難以克服一些問題,如并不是所有的腫瘤都能體現(xiàn)出EPR效應,腫瘤細胞的多藥耐藥現(xiàn)象使部分藥物不能有效地進入腫瘤細胞等等。要克服這些困難,則需要使載藥系統(tǒng)主動地靶向腫瘤細胞,主動靶向可以通過與細胞表面特定的受體相結合的配體或抗體來實現(xiàn)。
　　 本課題通過藥劑學、高分子材料學、藥理學、分子生

3、物學等手段的交叉應用,以喜樹堿(CPT)為模型藥物,轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)為靶向頭基,首先制備載CPT的主動靶向隱形納米載藥系統(tǒng),將聚乙二醇(PEG)修飾的被動靶向與Tf修飾的主動靶向作用相結合,有效遞送藥物到達腫瘤部位。
　　 本課題以琥珀酸酐為連接劑,首先合成了琥珀酰喜樹堿酯,并用N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化。用帶有雙功能基團的NHS-PEG-MAL分子上的NHS端與PAMAM上的氨基相連,合成了三種不同PEG化程度的PAMA

4、M-PEG(PP16,PP32和PP48),通過1HNMR計算PAMAM所連接的PEG數(shù)量并測定了粒徑和Zeta電位。喜樹堿琥珀酸活化酯與PAMAM表面剩余的氨基共價連接,合成了CPT-PAMAM-PEG納米載藥系統(tǒng)(CPP16,CPP32和CPP48)。藥物的體外釋放顯示出緩釋的特性(120小時內(nèi)累積釋放75％)。用Traut's試劑將轉(zhuǎn)鐵蛋白巰基化,合成了轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的主動靶向載藥納米復合物CPT-PAMAM-PEG-Tf(CPP1

5、6T,CPP32T和CPP48T),采用bradford法測得平均每個PAMAM復合物連接1分子轉(zhuǎn)鐵蛋白。連接轉(zhuǎn)鐵蛋白后復合物的粒徑增加了近一倍,Zeta電位由正負。轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的CPT復合物較CPT原料藥和未經(jīng)轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的復合物對KB,K562和S180細胞顯示出更強的抗腫瘤活性。細胞攝取實驗顯示轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的PAMAM-PEG復合物在KB、K562細胞中的攝取量分別為未經(jīng)Tf修飾復合物的3.38～3.46倍和2.52～2.86倍。

6、實驗顯示轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的PAMAM-PEG復合物在KB細胞中的攝取具有濃度依賴性,且轉(zhuǎn)鐵蛋白可以明顯抑制復合物的攝取,說明其通過細胞表面高表達的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導的內(nèi)吞進入細胞。
　　 以異硫氰酸羅丹明B(RBITC)為熒光標記物,合成了帶熒光標記物的RPP和RPPT。采用各種內(nèi)吞抑制劑對復合物的內(nèi)吞機制進行了初步探討,結果顯示RPP48和RPP48T都是由細胞表面的網(wǎng)格蛋白介導內(nèi)吞,RPP48T以細胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導的內(nèi)吞為

7、主。用Lysotrackergreen對細胞溶酶體進行染色,激光共聚集顯微鏡觀察表明復合物內(nèi)吞后經(jīng)溶酶體途徑轉(zhuǎn)運。
　　 采用Hochest和PI雙染對低濃度CPT復合物誘導腫瘤細胞凋亡的研究發(fā)現(xiàn),CPT,CPP48和CPP48T12h誘導細胞早期凋亡率分別為0.76％,2.41％和4.63％,24h分別為4.75％,16.02％和30.91％。說明CPP48T被腫瘤細胞攝取最多,誘導凋亡的效果最好。
　　 大鼠體內(nèi)藥動

8、學顯示復合物中PEG化程度越大,復合物在體內(nèi)的半衰期和平均滯留時間越長,AUC也越大,但是經(jīng)轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的復合物較未經(jīng)Tf修飾的復合物的半衰期短。S180荷瘤小鼠體內(nèi)的組織分布結果表明CPP48T給藥后藥物在腫瘤內(nèi)的達峰濃度最高,分別是CPT和CPP48的8.4和2.7倍,AUC分別是CPT和CPP48的28.7和3.6倍。CPP48T的相對靶向效率最高(28.7),顯示CPP48T的腫瘤靶向性最強。
　　 對S-180荷瘤小鼠