抗惡性瘧原蟲特異性人源抗體Fab片段的制備和研究.pdf

1、目的：利用抗體庫(kù)技術(shù)及大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，制備抗惡性瘧原蟲人源抗體，為研制瘧疾治療性抗體提供部分理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：首先選擇位于惡性瘧原蟲裂殖子表面、參與蟲體入侵宿主紅細(xì)胞的蛋白分子MSP119作為抗體庫(kù)篩選的靶的抗原，應(yīng)用DNA重組技術(shù)將擴(kuò)增得到的Pfmsp119基因克隆入原核表達(dá)載體pET19b中，轉(zhuǎn)化宿主菌BL21 Star(DE3)(pLysS)、誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，金屬螯合親和層析純化重組蛋白，以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

2、(ELISA)檢測(cè)該重組蛋白的抗原特異性。分離惡性瘧患者的外周血淋巴細(xì)胞，利用工程抗體技術(shù)構(gòu)建具有一定庫(kù)容量的人抗惡性瘧原蟲免疫球蛋白G基因文庫(kù)。采用克隆印跡法、ELISA、間接免疫熒光反應(yīng)(IFA)等多種方法以重組蛋白對(duì)抗體庫(kù)進(jìn)行較大規(guī)模的篩選驗(yàn)證，對(duì)所得陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序和結(jié)構(gòu)分析。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行大量表達(dá)，并以金屬螯合親和層析法進(jìn)行純化，經(jīng)ELSIA、免疫印跡、IFA等檢測(cè)純化Fab片段能否特異性識(shí)別天然及重組惡性瘧原蟲表面抗原。Bi

3、acore檢測(cè)純化Fab片段的親和力，體外抑制實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其是否具有抑制惡性瘧原蟲裂殖子入侵宿主紅細(xì)胞的功能。利用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)重組抗體進(jìn)行改造以期提高該抗體的親和力。
　　 結(jié)果：應(yīng)用DNA重組技術(shù)獲得了高純度的MSP119重組蛋白2mg/100ml培養(yǎng)液，能被抗惡性瘧原蟲蟲特異性抗體的血清識(shí)別、具有抗原特異性。構(gòu)建了庫(kù)容量為5×107的人抗惡性瘧原蟲抗體庫(kù)。對(duì)抗體庫(kù)經(jīng)過(guò)多輪篩選，從8×105個(gè)克隆中篩到兩個(gè)陽(yáng)性克隆，分別命名為P

4、f25、Pf227；Pf25的重鏈可變區(qū)近似系為VH1-8、基因同源性為97％，輕鏈可變區(qū)近似系為A27、基因同源性為100％；Pf227的重鏈可變區(qū)近似系為VH1-8、基因同源性為98％，輕鏈可變區(qū)近似系為A27、基因同源性為99％。分別對(duì)兩個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行表達(dá)純化，得到重輕鏈結(jié)構(gòu)完整、純度較高的抗體Fab片段，均可特異性識(shí)別天然及重組惡性瘧原蟲表面抗原。Biacore檢測(cè)顯示，Pf25的解離常數(shù)為1.09×10-9M，Pf227的解離