囊泡轉運的動態(tài)跟蹤及其與脂筏關系的初步研究.pdf

1、細胞物質轉運實質上是細胞內的一個龐大而復雜的物流系統(tǒng)，這一系統(tǒng)的異常將導致相應各種疾病的發(fā)生。囊泡是這一物流系統(tǒng)中的一種可調控的重要的運輸工具，脂筏是膜脂雙層內含有特殊脂質及蛋白質的微區(qū)，在這一物流系統(tǒng)中具有重要的作用。本課題引入單分子研究技術和全內反射熒光成像技術，實時動態(tài)地研究轉運囊泡的動力學過程，和兩類脂筏與囊泡之間的動態(tài)空間定位關系。這一研究有助于我們進一步揭示囊泡轉運機制和糖尿病的發(fā)生機制，而且對于進一步認識脂筏功能及開發(fā)以G

2、LUT4為靶的調節(jié)血糖的藥物都具有重要的理論及實際指導意義。機體內葡萄糖的平衡對生命過程至關重要。胰島素是調節(jié)血糖平衡的重要激素，它促進葡萄糖進入細胞內，從而降低血中葡萄糖。胰島素的這一作用是通過細胞內的葡萄糖轉運體(GlucoseTransporter,GLUT)家族之一葡萄糖轉運子4(GLUT4)將葡萄糖從細胞外轉運到細胞內的。研究表明II型糖尿病的發(fā)生與細胞內GLUT4的轉運障礙有關。而GLUT4的轉運被認為是受多種因素控制的，這

3、些因素目前較公認的有GLUT4在細胞器中的保持機制、動態(tài)分選、囊泡的轉運、錨定和與質膜的融合以及質膜的脂質結構。GLUT4在細胞內的轉運至少有兩個循環(huán)，一個是細胞表面和內涵體間的循環(huán)，一個是在trans-Golginetwork(TGN)和內涵體間的循環(huán)。在這兩個循環(huán)中GLUT4轉位有幾個嚴格的控制點。這兩個循環(huán)似乎告訴我們GLUT4在胞內可能有兩種運動形式。為了回答這個問題，我們研究了GLUT4在胞內的動力學過程。在研究過程中使用Co

4、nfocal顯微鏡觀察了GLUT4在胞內的整體分布。使用全內反射熒光顯微鏡時序成像獲得了GLUT4的動態(tài)連續(xù)的圖像，用于三維動力學分析。分析中發(fā)展了單顆粒追蹤方法(SPT)，使之能跟蹤亞象素的位移，發(fā)現(xiàn)GLUT4在胞內雖然有兩個循環(huán)路徑，但是在無刺激的情況下，它的運動呈現(xiàn)限制性運動，其分散系數(shù)呈現(xiàn)一種連續(xù)的平滑的分布，即其運動并未因循環(huán)有兩個路徑而分成幾種形式。此外，我們初步研究了囊泡轉運與細胞膜脂筏的關系。首先構建了含熒光標記的Cav

5、eolin和flotillin兩類脂筏特異性蛋白表達質粒。研究了它們分別與大囊泡標記物NPY的動態(tài)定位關系。發(fā)現(xiàn)Caveolin無論是在靜息還是在高鉀刺激下都沒有明顯的與NPY大囊泡的共存，與SNAP25也沒有明顯的共存現(xiàn)象。同樣flotillin與NPY大囊泡也沒有明顯的共存關系，而且flotillin自身在TIRFM下呈一種片狀分布，這說明flotillin在表達后即分布在細胞膜上。從定位關系看脂筏標記蛋白沒有明顯的參與大囊泡的轉運