tmTNF-α殺傷效應(yīng)的分子機(jī)制及其與脂筏的關(guān)系.pdf

1、TNF-α是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，以26kDa膜蛋白的形式表達(dá)于細(xì)胞膜表面（transmembrane tumor necrosis factor,tmTNF-α），在金屬基質(zhì)蛋白酶或其它酶類(lèi)的作用下剪切為17 kDa的可溶性分子（secret tumor necrosis factor, sTNF-α），參與細(xì)胞的凋亡，增殖和分化。兩型TNF-α通過(guò)其特異性受體（TNFR1和TNFR2）介導(dǎo)生物學(xué)活性，而tmTNF-α與T

2、NFR2親和力高于sTNF-α，二者生物學(xué)效應(yīng)不盡相同。
　　本課題組前期工作以及國(guó)外的研究表明,在抗腫瘤方面，tmTNF-α可殺傷對(duì)sTNF-α耐受的腫瘤細(xì)胞株，其殺瘤譜更廣：前者主要誘導(dǎo)凋亡，后者主要誘導(dǎo)壞死。tmTNF-α在體內(nèi)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞表達(dá)Fas，通過(guò)FasL/Fas途徑殺傷腫瘤；而sTNF-α則主要通過(guò)誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)抗腫瘤免疫發(fā)揮效應(yīng)。tmTNF-α與受體結(jié)合后，可通過(guò)受體介導(dǎo)的正向信號(hào)抑制NF-kB，誘導(dǎo)腫

3、瘤細(xì)胞凋亡；但是腫瘤細(xì)胞自身高表達(dá)tmTNF-α則可通過(guò)反向信號(hào)引起NF-kB活化,促進(jìn)細(xì)胞存活，抵抗凋亡刺激信號(hào)。由此可見(jiàn)TNF-α的膜分子與其可溶性分子在生理和病理生理作用上可能存在很大差異。
　　TNFR1信號(hào)傳導(dǎo)通路的分子機(jī)理已了解得十分清楚。但是，tmTNF-α如何啟動(dòng)TNFR2凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚不清楚。且兩型TNF-α生物學(xué)活性差異的分子機(jī)制是什么?也是亟待研究和解決的問(wèn)題。
　　本研究上篇旨在比較兩型TNF-α

4、通過(guò)TNFR2信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和生存信號(hào)的差異及其分子機(jī)制，下篇?jiǎng)t探討脂筏在兩型TNF-α通過(guò)TNFR1殺傷效應(yīng)中的作用及其機(jī)制，該研究不但深入闡明兩型TNF-α的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制，而且為抗腫瘤治療提供新的分子靶點(diǎn)和干預(yù)線索。
　　上篇比較兩型TNF-α通過(guò)TNFR2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和生存信號(hào)的差異其主要研究結(jié)果如下：
　　一、兩型TNF-α通過(guò)TNFR2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或生存
　　1.效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞的選擇

5、>　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面膜蛋白表達(dá)率分別為：穩(wěn)轉(zhuǎn)人tmTNF-α的NIH3T3細(xì)胞系表面tmTNF-α表達(dá)率為47.7％，可作為表達(dá)tmTNF-α的效應(yīng)細(xì)胞；HL-60細(xì)胞TNFR2表達(dá)量高，而TNFR1表達(dá)量低，故用該細(xì)胞作為靶細(xì)胞，研究TNFR2信號(hào)通路。
　　2．兩型TNF-α對(duì)HL-60細(xì)胞的殺傷效應(yīng)不同
　　兩型TNF-α通過(guò)TNFR2對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生死亡或生存效應(yīng)，tmTNF-α通過(guò)TNFR2促使腫瘤細(xì)胞凋亡，

6、而sTNF-α則通過(guò)TNFR2介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生存。
　　3.兩型TNF-α對(duì)HL-60細(xì)胞周期的影響
　　tmTNF-α組可使G2期的細(xì)胞數(shù)下降，但與之相比，G1細(xì)胞下降更為明顯，降低61％；而sTNF-α組S期與control相比略有下降，但無(wú)顯著差異。這一結(jié)果表明，tmTNF-α主要誘導(dǎo)G1期細(xì)胞凋亡。
　　4.蛋白合成對(duì)兩型TNF-α效應(yīng)的影響不同
　　與對(duì)照組相比，tmTNF-α可有效殺傷HL-60，其殺

7、傷率79％，加入蛋白合成抑制劑放線菌酮可明顯抑制tmTNF-α對(duì)HL-60細(xì)胞的殺傷。sTNF-α對(duì)HL-60無(wú)明顯殺傷，加入放線菌酮使sTNF-α對(duì)HL-60的胞毒作用敏感性增加，其殺傷率為38％。提示tmTNF-α的胞毒作用需要依賴(lài)蛋白質(zhì)合成，而sTNF-α與tmTNF-α完全不同，其殺傷靶細(xì)胞需要抑制蛋白合成。
　　5.轉(zhuǎn)染TNFR1 siRNA對(duì)tmTNF-α殺傷HL-60細(xì)胞無(wú)影響
　　轉(zhuǎn)染TNFR1 siRNA與

8、未轉(zhuǎn)染組相比，對(duì)tmTNF-α的殺傷效應(yīng)無(wú)明顯影響， tmTNF-α仍然可有效地殺傷HL-60，其殺傷率為77％（***p<0.001.vs NIH3T3）。這一結(jié)果提示TNFR1不介導(dǎo)tmTNF-α對(duì)HL-60細(xì)胞的殺傷。
　　6.轉(zhuǎn)染TNFR2 siRNA可顯著降低tmTNF-α對(duì)HL-60細(xì)胞的殺傷
　　未轉(zhuǎn)染組中，tmTNF-α可有效地殺傷HL-60，其殺傷率為63％（***p<0.001.vs NIH3T3），而s

9、TNF-α卻無(wú)殺傷作用。但是，當(dāng)轉(zhuǎn)染了TNFR2 siRNA后，tmTNF-α的殺傷效應(yīng)顯著降低（***p<0.001.vs tmTNF-α/NIH3T3），而對(duì)sTNF-α則無(wú)影響。該結(jié)果表明tmTNF-α對(duì)HL-60的殺傷主要依賴(lài)TNFR2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　二、tmTNF-α通過(guò)TNFR2募集死亡信號(hào)，解離生存信號(hào)
　　我們前期工作利用TNFR2抗體進(jìn)行IP-Western，證實(shí)tmTNF-α通過(guò)TNFR2募集FADD

10、、RIP與caspase8等死亡信號(hào)，而sTNF-α則通過(guò)TNFR2募集TRAF1、TRAF2、TRAF3、cIAP1、cIAP2和cFLIP等抗凋亡和生存信號(hào)，但是，tmTNF-α卻導(dǎo)致這一生存信號(hào)的喪失。我們假設(shè)tmTNF-α導(dǎo)致某些接頭分子的降解，進(jìn)而使生存信號(hào)與TNFR2解離。
　　1. tmTNF-α通過(guò)TNFR2使TRAF2與cIAP-1發(fā)生泛素化而被降解
　　2. tmTNF-α通過(guò)TNFR2抑制抗凋亡分子cF

11、LIP合成
　　3. tmTNF-α通過(guò)TNFR2介導(dǎo)NF-κB失活，而sTNF-α則通過(guò)TNFR2介導(dǎo)NF-κB的經(jīng)典和非經(jīng)典途徑的活化
　　下篇脂筏在兩型TNF-α通過(guò)TNFR1殺傷效應(yīng)中的作用及其機(jī)制
　　其主要結(jié)果如下：
　　一、脂筏可促進(jìn)tmTNF-α的胞毒效應(yīng)，卻抑制sTNF-α的殺傷作用
　　二、脂筏抑制sTNF-α殺傷作用的機(jī)制
　　1.脂筏下調(diào)sTNF-α在胞漿內(nèi)通過(guò)TNFR1募集D

12、ISC死亡信號(hào)，促進(jìn)sTNF-α在胞膜上通過(guò)TNFR1募集TRAF2和RIP1等生存信號(hào)
　　2.脂筏阻止sTNF-α誘導(dǎo)caspase8和caspase3的活化
　　三、脂筏促進(jìn)tmTNF-α胞毒效應(yīng)的機(jī)制：
　　1.脂筏促進(jìn)tmTNF-α對(duì)caspase8和caspase3的活化
　　2.脂筏外TRAF2可部分拮抗tmTNF-α的殺傷作用
　　3.脂筏外TRAF2可抑制tmTNF-α誘導(dǎo)的DISC信號(hào)<