脂筏對tmTNF-a雙向信號影響的研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：酶切位點缺失的跨膜型TNF-α突變體的構建及其功能的研究
　　 跨膜型TNF-α(tmTNF-α)是sTNF-α的前體，分子量為26kD，主要表達在活化的單核細胞和免疫細胞表面。tmTNF-α在N端比sTNF-α多76個氨基酸組成的引導肽，具有疏水區(qū)，故可跨膜成為膜分子。表達于細胞膜表面的tmTNF-α在TNF轉化酶(TACE/ADAM17)的作用下，被剪切釋放出sTNF-α。

2、　　 由于tmTNF-α可被剪切成sTNF-α，為了排除sTNF-α的影響，在研究tmTNF-α生物學功能的時候需要用其酶切位點缺失的突變體。常用的缺失1-12位的突變體雖然基本不被TACE剪切，但是其正向信號介導的胞毒效應下降，反向信號傳遞缺陷，故不是一個理想的研究tmTNF-α的突變體。有報道稱△1-9，K11E突變體也不被TACE剪切，并且其胞毒效應和野生型tmTNF-α一致，但是這種突變是否影響tmTNF-α反向信號尚不清楚。

3、
　　 本研究通過定點突變的方法，將tmTNF-α的酶切作用位點缺失，使得tmTNF-α不被剪切為sTNFα；并研究突變體對正反向信號的影響。主要結果如下：
　　 1.利用重疊PCR技術，成功構建△1-12 tmTNF-α、△1-9，K11E tmTNF-α突變體，經酶切鑒定，PCR鑒定及測序鑒定確認除預期突變外，無任何其它點突變，移碼及缺失突變。
　　 2.將tmTNF-α及其突變體轉染Hela細胞后，經Wes

4、tern blot鑒定wt tmTNF-α在26kD處有特異性條帶，突變體在25kD左右有特異性條帶，符合預期分子量。
　　 3.用野生型tmTNF-α及其突變體轉染Hela細胞，證實轉染野生型tmTNF-α的細胞能分泌大量的sTNF-α，而轉染△1-12 tmTNF-α和△1-9，K11E tmTNF-α突變體的細胞上清均未檢測到sTNF-α，提示兩個缺失突變體都喪失被TACE酶解為sTNF-α的能力。
　　 4.用生

5、物活性檢測證實wt tmTNF-α和△1-9，K11E tmTNF-α對靶細胞有明顯的殺傷作用；但是△1-12 tmTNF-α的胞毒效應卻減少了近一半，說明△1-9，K11E tmTNF-α保留了野生型tmTNF-α正向信號介導的胞毒效應。
　　 5.用Westeill blot檢測證實△1-9，K11E tmTNF-α與wt tmTNF-α一樣能通過其反向信號有效降解IκB-α，激活NF-κB，而△1-12 tmTNF-α則失

6、去了這種能力。
　　 上述結果表明△1-9，K11E tmTNF-α突變體既喪失被酶解的能力，又能保留野生型tmTNF-α正向信號和反向信號傳遞能力，為進一步研究tmTNF-α的生物學功能提供了有力的工具。
　　 第二部分：脂筏與tmTNF-α的正/反向信號
　　 脂筏是近年被發(fā)現的存在于細胞膜上微結構域，區(qū)別于經典的胞膜脂質雙分子層，它富含膽固醇、磷脂酰肌醇。己知很多受體及其相關的信號分子均能分布在脂筏內。由于

7、脂筏在質膜上分布比較分散，且能側向漂移和聚集，故可形成信號轉導平臺，參與活化受體募集信號轉導分子，向胞內傳遞信號。
　　 tmTNF-α不僅能和受體結合，向靶細胞傳遞正向信號，本身還能作為受體，用其胞內段募集信號分子，傳遞反向信號。有報道tmTNF-α的-47位半胱氨酸是棕櫚?；；稽c，故我們推測tmTNF-α可能定位在脂筏中，但是tmTNF-α與脂筏的關系尚不清楚。此外，TNFR也能定位在脂筏，脂筏內外的TNFR與tmTN

8、F-α之間的關系也不清楚。
　　 為闡明tmTNF-α與脂筏的關系，我們利用蔗糖密度梯度離心法提取脂筏結構，明確tmTNF-α的脂筏定位；并從表達tmTNF-α的效應細胞和表達TNFR的靶細胞兩方面入手，研究脂筏在tmTNF-α正反向信號傳導中的作用。其主要結果如下：
　　 1.脂筏與tmTNF-α反向信號
　　 1.1 tmTNF-α可定位脂筏內：利用蔗糖密度梯度離心法分離高表達tmTNF-α的Raji細胞的脂

9、筏結構，用Western blot檢測證實部分tmTNF-α定位在脂筏內。用10mMMCD破壞脂筏，所有tmTNF-α均分布到脂筏外。
　　 1.2 脂筏內tmTNF-α導致sTNF-α耐受：高表達tmTNF-α的Raji細胞對sTNF-α耐受，用MCD破壞脂筏后對sTNF-α胞毒效應的敏感性明顯增加；而低表達tmTNF-α的T24細胞對sTNF-α敏感，脂筏破壞后，sTNF-α的胞毒效應也明顯增強。提示定位在脂筏內的tmTNF

10、-α可導致sTNF-α耐受
　　 1.3 破壞脂筏導致NF-κB活性下降：高表達tmTNF-α的Raji細胞經MCD處理后，IκB-α降解明顯受到抑制；而低表達tmTNF-α的T24細胞經MCD處理后，IκB-α水平則無明顯變化。提示破壞脂筏能使tmTNF-α反向信號減弱。
　　 1.4建立穩(wěn)轉完全定位在脂筏內或外的tmTNF-α突變體的細胞株：利用重組PCR成功構建cav-tmTNF-α和C-47A tmTNF-α突變

11、體，連同野生型tmTNF-α穩(wěn)轉T24細胞。提取脂筏分析證實cav-tmTNF-α完全定位于脂筏內，而C-47A tmTNF-α則完全定位于脂筏外。
　　 1.5 脂筏內tmTNF-α誘導對sTNF-α胞毒效應的耐受：用胞毒實驗證實sTNF-α可有效殺傷定位在脂筏外的C-47A tmTNF-α表達細胞，而對部分定位脂筏內的wttmTNF-α表達細胞的胞毒效應則明顯下降。提示只有脂筏內的tmTNF-α才可導致細胞抵抗sTNF-α的

12、胞毒效應。
　　 1.6 脂筏內tmTNF-α可組成性活化NF-κB：Western blot證實部分定位脂筏內的wttmTNF-α可組成性降解IκB-α，使NF-κB p65磷酸化；而僅在脂筏外的C-47AtmTNF-α則無此作用。
　　 1.7 脂筏內tmTNF-α可上調抗凋亡分子cIAP1基因表達，下調促凋亡分子Bax基因表達：用Real time PCR檢測證實部分定位在脂筏內的wt tmTNF-α誘導cIAP1

13、基因表達明顯增加，卻明顯抑制Bax的基因轉錄；但是定位在脂筏外的C-47AtmTNF-α則無明顯影響。
　　 1.8 CKI抑制劑D4476可增強脂筏內tmTNF-α對sTNF-α的抵抗：用CKI的特異性抑制劑抑制tmTNF-α的磷酸化，增強反向信號，結果可增強轉染wt tmTNF-α細胞對sTNF-α胞毒效應的抵抗，卻對sTNF-α殺傷定位在脂筏外的C-47A tmTNFα
　　 表達細胞則無明顯作用。提示tmTNFα

14、誘導的sTNF-α耐受是由定位在脂筏內的tmTNF-α通過其反向信號介導的。
　　 1.9 tmTNF-α以脂筏為平臺傳遞反向信號：用可溶性TNF受體刺激tmTNF-α反向信號或轉染定位脂筏內、外的tmTNF-α及其突變體證明激活tmTNF-α可導致該分子本身向脂筏內聚集，且募集其反向信號分子TRAF1、IKK-α和NF-κBp52至脂筏內；而定位在脂筏外的C-47A tmTNF-α則對這些信號分子脂筏內外的分布無影響。提示tm

15、TNF-α可能是以脂筏為平臺傳遞反向信號的。
　　 2.脂筏與tmTNF-α正向信號
　　 2.1效應細胞脂筏對tmTNF-α正向信號介導的生物學功能的影響
　　 2.1.1 tmTNF-α胞毒效應與其定位脂筏內外無關：用MCD破壞Raji細胞的脂筏，發(fā)現與TNF抗體封閉一樣，幾乎可以完全阻斷tmTNF-α對T24細胞的胞毒效應。
　　 但是，轉染野生型tmTNF-α、完全定位在脂筏外的C-47A tmT

16、NF-α突變體或完全定位在脂筏內的cav-tmTNF-α突變體的效應細胞都具有相似的胞毒效應，三者間無明顯差異，提示效應細胞脂筏內外的tmTNF-α均可有效殺傷靶細胞，即tmTNF-α殺傷靶細胞與其是否定位脂筏無關。
　　 2.1.2 破壞ICAM-1脂筏定位抑制效靶細胞粘附，從而阻斷tmTNF-α胞毒效應：
　　 用MCD破壞脂筏則所有ICAM-1分布至脂筏外，效/靶細胞粘附下降，tmTNF-α
　　 胞毒作用

17、幾乎被完全阻斷，而ICAM-1中和抗體可部分抑制效/靶細胞之間的粘附，并部分阻斷tmTNF-α胞毒作用。提示MCD阻斷tmTNF-α胞毒效應是由于破壞粘附分子脂筏定位，進而抑制效/靶細胞粘附所致。
　　 2.1.3 破壞脂筏導致sTNF-α分泌增加：用MCD破壞Raji細胞的脂筏，可導致部分本來分布在脂筏內的TACE轉至脂筏外，sTNF-α產生明顯增加。
　　 2.2 靶細胞脂筏對tmTNF-α正向信號介導的生物學效應的

18、影響
　　 2.2.1 tmTNF-α刺激誘導靶細胞TNFR1向脂筏內聚集：用固定的高表達tmTNF-α的Raji細胞作用于T24細胞，可見T24細胞大量TNFR1從脂筏外轉移至脂筏內，此結果提示TNFR定位在脂筏可能影響tmTNF-α的正向信號。
　　 2.2.2 sTNF-α及脂筏內外的tmTNF-α對靶細胞脂筏內外TNFR1的作用：用MCD破壞靶細胞脂筏導致sTNF-α胞毒效應顯著增加，卻明顯抑制wt tmTNF-