采用隨機PCR方法對臨床標本中未知RNA病毒鑒定的研究.pdf

1、目的：
　　 分別以臨床糞便標本中已知腸道病毒和含漱液標本中已知呼吸道病毒為假設未知RNA病毒，在隨機PCR技術的基礎上，通過對標本前處理方法的改進，探索一種不依賴于病毒培養(yǎng)，直接對臨床標本中未知RNA病毒作出鑒定的分子生物學方法。
　　 方法：
　　 1、臨床標本的前處理：首先對臨床標本進行前處理，包括反復凍融、低溫離心、微孔膜過濾、聚乙二醇濃縮，以及核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶的處理。通過對臨床標本前處理方法的

2、改進與優(yōu)化，盡可能地去除標本中的無關核酸，以增大病毒核酸在標本中所占的比例，提高陽性檢出率。
　　 (1)將臨床糞便和含漱液標本反復凍融3次后，3000r/min離心10min，使包裹于細胞中的病毒充分釋放，以提高標本中病毒含量。
　　 (2)經0.22μm濾膜過濾，去除細胞碎片、雜質和細菌等顆粒物質。
　　 (3)在濾液中加入10％的聚乙二醇6000，用以濃縮病毒液。37℃孵育1h后，于4℃過夜。次日12000

3、r/min4℃離心30min，沉淀用200μl焦碳酸二乙酯水懸浮。
　　 (4)在200μl懸浮液中加入15μ,1200μg/ml的核糖核酸酶A，37℃溫浴2h，以除去標本液中游離的RNA。
　　 (5)核糖核酸酶處理之后立即提取病毒RNA,在RNA提取液中加入脫氧核糖核酸酶，37℃溫浴30min，以去除RNA中的DNA污染物。
　　 2、病毒RNA的提取、逆轉錄與隨機PCR擴增：對經前處理后的臨床標本提取病毒R

4、NA，在反轉錄酶的作用下，以錨定隨機引物合成第一鏈互補cDNA，在KlenowDNA聚合酶的作用下，合成雙鏈cDNA。用cDNA作模板，以錨定特異性引物進行PCR擴增。
　　 3、擴增產物回收純化與克隆：根據Marker的位置切取300～1500bp區(qū)域的凝膠條，回收純化PCR產物，將純化的目的片段與pGEM-Teasy載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，根據藍白斑篩選原理，隨機挑取若干分離良好的白斑，增菌培養(yǎng)。以菌液為模

5、板進行PCR擴增，驗證載體中有無插入片段。
　　 4、測序及比對：將獲得的陽性克隆進行DNA序列測定。獲得的測序結果在NCBI上進行BLAST在線比對，根據同源性確定核酸片段的來源，并最終實現(xiàn)對未知病毒的鑒定。
　　 5、不明病原的臨床標本驗證：采用本研究所建立的方法對6份具有疑似流感癥狀但流感病毒檢測呈陰性的咽拭子標本進行未知病毒鑒定，用以對方法的實用性與臨床效果加以驗證，同時也以期查明該時期除流感病毒外，引起患兒流感

6、樣癥狀的主要病原體。
　　 結果：
　　 1、糞便標本陽性克隆的插入序列經BLAST比對后結果：糞便標本的所獲得8個克隆中有6個克隆與人腸道致細胞病變孤兒病毒（簡稱?？刹《荆?4型同源性最高，達95％～99％；其余2個克隆與細菌同源性很高。本研究從病毒載量為1.0×106Cope/ml的糞便標本中，以75％的病毒陽性克隆率的檢出了標本中的腸道病毒。
　　 2、含漱液標本陽性克隆的插入序列經BLAST比對后結果：含

7、漱液標本10個陽性克隆中，有7個與甲3亞型流感病毒(H3N2)同源性最高(99％～100％)，其余3個為細菌和人基因組DNA。本研究通過對標本前處理方法的改進，從病毒載量為4.8×103Cope/ml的含漱液標本中，以70％的病毒陽性克隆率檢測出標本中的甲3亞型流感病毒病毒。
　　 3、臨床標本驗證結果：對6份具有疑似流感癥狀但流感病毒檢測呈陰性的咽拭子標本檢測后發(fā)現(xiàn)，除1份標本無陽性結果外，其他5份中有1份標本病毒陽性克隆的插

8、入序列與基因庫公布的人腸道致細胞病變孤兒病毒9型同源性最高(96％～99％)；另外4份標本病毒陽性克隆的插入序列與柯薩奇病毒A組4型同源性最高(97％～100％)。
　　 結論：
　　 本研究成功建立了一種基于隨機PCR的未知RNA病毒的檢測方法，其優(yōu)點在于不依賴病毒的細胞培養(yǎng)及其核酸序列信息，并且能極大地提高對RNA病毒鑒定的陽性率，這種方法的建立為檢測不明原因疾病和新發(fā)傳染病病原體提供了新的思路，這將在不明原因疾病和