基于組合PCR的近緣物種鑒定方法的研究.pdf

1、不同物種在商品價值、品質、潛在過敏原種類和受保護程度等方面存在較大的差異,因此亟需建立一種簡單、快速、可靠、重復性高的檢測方法來保障消費者的權益、規(guī)范食品市場和保護瀕危物種。目前分子學鑒定方法能夠準確的區(qū)分不同目、科的物種,但對于同屬的多個近緣物種的區(qū)分仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。本研究改進了傳統(tǒng)的物種特異性 PCR,設計多套中等特異性引物,通過綜合分析幾個PCR的結果來確定物種的身份。由中等特異性引物建立的多個PCR稱為組合PCR。本文建立的

2、組合PCR方法較傳統(tǒng)物種特異性PCR的優(yōu)勢在于:對序列高度相似的近緣物種設計只擴增一個物種的引物是困難的,而組合 PCR對引物特異性要求較低即允許引物擴增幾個物種,因此引物設計相對容易;傳統(tǒng)物種特異性PCR對假陰性、假陽性結果很敏感,而組合PCR中個別PCR結果出現假陰性或假陽性結果并不會對鑒定結果有本質的影響,仍然可以根據組合 PCR的結果判斷樣本的疑似身份;組合 PCR同時利用了多個目的片段,從多個角度反映樣品身份,比傳統(tǒng)的物種特異

3、性PCR準確性更高;傳統(tǒng)PCR鑒別物種時,所需的特異性引物數量一般等于甚至大于待區(qū)分物種的數量,而組合 PCR中由于各 PCR間交叉效果,其能夠用相對較少的反應鑒別多個物種。本文選取金槍魚屬的所有金槍魚(7種)為研究對象,設計中等特異性引物,建立組合 PCR方法,并驗證了該方法的實用性和準確性。
　　首先,本文根據7種金槍魚在NCBI中的序列信息,針對編碼蛋白基因設計了6套中等特異性引物,并使用經過形態(tài)學鑒定的3種金槍魚(長鰭、黃

4、鰭、大目金槍魚)的多個個體探索引物特異性發(fā)揮的合適條件。理論上使用5個 PCR反應(共使用4套引物和3個反應條件)即可對5種金槍魚身份進行準確區(qū)分,可將另外2種金槍魚與其他金槍魚分開。
　　其次,根據一定條件下3種金槍魚種內多個個體的PCR結果的一致性和對引物結合位點直接測序兩種方法,對引物種內保守程度進行評價。兩種評價結果均表明:實驗所用的4套引物種內保守程度良好。雖少數個體的個別引物結合位置存在變異,但變異位于引物5端,對PC

5、R結果影響基本可以忽略。
　　再次,通過對真實樣品的序列測定,總結了在特定條件下引物真實的區(qū)分模板的能力。同時結合沒有實際樣品的金槍魚種的數據庫中信息,得出能夠鑒別7種金槍魚的組合PCR模型(共使用4套引物)。結果表明:4套引物針對7種金槍魚建立了6種組合PCR模型;長鰭和太平洋藍鰭金槍魚間序列的高度相似性,這兩種魚具有相同的PCR模型,本文針對金槍魚建立的組合PCR方法尚不能區(qū)分它們。
　　另外,本文利用上述方法鑒別市售的

6、金槍魚身份并對部分樣品(未知樣品和標準樣品)測序建立基因樹或SNP位點分析,結果表明:組合PCR鑒定結果和形態(tài)學鑒定、其他分子學方法鑒定的結果一致,從而驗證了組合 PCR結果檢測的準確性。
　　最后,本文建立了快速提取DNA的方法,所得DNA的完整性高。本文還對錯配堿基種類、數目、聚合酶種類、引物模板比對引物區(qū)分能力的影響進行簡單探索,這對組合 PCR引物設計和條件優(yōu)化有一定的參考價值。經過優(yōu)化后的組合PCR方法更加簡單、快速。<