Hv1的原核表達、多克隆抗體制備及其在組織中表達的初步研究.pdf

1、電壓門控質子通道廣泛存在于多種細胞與組織中,在生物體的生命活動中發(fā)揮了重要的生理功能。尤其是在免疫系統(tǒng)中,電壓門控質子通道發(fā)揮了關鍵作用。而人電壓門控質子通道Hv1于2006年才從分子水平上得到確定,因此其功能方面的研究仍存在許多未知。本文用基因重組,克隆的方法構建出Hv1的表達載體,并通過原核系統(tǒng)表達純化出Hv1蛋白,然后用純化的蛋白制備多克隆抗體。繼而通過免疫染色,免疫熒光的方法檢測其在大鼠腦缺血,人乳腺癌等組織中的表達情況。通過受

2、損的組織檢測,初步研究其在免疫系統(tǒng)中的作用。
　　 目的:
　　 1.表達純化出Hv1蛋白。
　　 2.用純化的蛋白制備出小鼠抗Hv1的多克隆抗體。
　　 3.通過抗體檢測Hv1在組織中的表達情況。
　　 方法:
　　 1.構建原核表達載體,并經酶切證實。IPTG誘導表達Hv1融合蛋白,將重組基因工程菌擴大誘導表達,用GST特異結合方法,分離純化蛋白。
　　 2.將純化的蛋白與弗氏

3、佐劑乳化,將其作為抗原免疫BALB/c小鼠,免疫四次,每次免疫間隔10天,獲得小鼠抗Hv1的多克隆抗體,并通過間接ELISA檢測多克隆抗體效價。
　　 3.建立SD大鼠的腦缺血模型,收集得到乳腺癌組織,制作SD大鼠大腦的冰凍切片,乳腺癌組織的石蠟切片。用免疫熒光的方法檢測其在腦缺血中的表達情況,同時進行正常腦的免疫熒光實驗,與腦缺血進行對比。通過雙染的方法檢測Hv1在腦缺血情況下的小膠質細胞,星形膠質細胞,和神經元的表達情況。用

4、免疫組化的方法檢測Hv1在乳腺癌組織,正常乳腺組織,和乳腺增生組織中的表達情況。
　　 結果:
　　 1.成功構建Hv1蛋白表達載體,DNA電泳檢測表明構建出Hv1的原核表達載體。
　　 2.表達并純化出Hv1蛋白,并通過SDS—PAGE驗證所表達的蛋白為目的蛋白。純度高于99％。
　　 3.得到小鼠抗Hv1的多克隆抗體,抗體效價高于1:100000。
　　 4.Hv1在大腦缺血的情況下大量表達,