Pyridoxine對晚期糖基化終產物導致血小板功能損傷的保護作用及機制的研究.pdf

1、非胰島素依賴型糖尿病(Non-insulin dependent diabetes mellitus．NIDDM)是世界范圍內發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。心血管并發(fā)癥是NIDDM的主要致死致殘的原因。糖尿病所致的微血管病變、視網膜病變、神經病變、腎血管以及大血管病變均會加速動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。糖尿病微血管病變的高發(fā)率與其發(fā)病機制密切相關，有學者認為糖尿病高發(fā)率是由于血小板的功能異常所導致的。因為血小板本身在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過

2、程中起著極其重要的作用，并且在對NIDDM患者研究發(fā)現，其血小板均處于高活性狀態(tài)。激活血小板的因素很多，高血糖是導致糖尿病合并動脈粥樣硬化的一個重要因素。眾所周知，慢性高血糖是糖尿病血管并發(fā)癥的始動因素。體內高血糖介導的代謝以及血液動力學改變可能是由于體內晚期糖基化終產物(advanced glycation ends products，AGEs)的堆積造成的。大量研究表明:AGEs可以直接促進血小板聚集，但是其具體的機制少有報道。已有

3、研究證實，在內皮細胞上，AGEs通過抑制內皮依賴性一氧化氮(endothelial nitric oxide，eNOS)的活性產生損傷作用,然而在血小板上其具體機制目前尚未明確。 一氧化氮(NO)是內皮產生的最主要的血管舒張因子，越來越多的研究證實NO除了具有血管舒張功能外，還具有抗血小板聚集以及維持血管內環(huán)境平衡的作用。NO是L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)催化下的產物，NOS有三種亞型：內皮型(eNOS)，神經型(nNOS

4、)和誘導型(iNOS)。目前研究認為存在于血小板上面的主要是eNOS。eNOS起調節(jié)心血管功能中起重要的作用，適當的調節(jié)eNOS的生物活性可能成為預防一些心血管疾病的新靶點。已知P13k/Akt是影響內皮eNOS活性的經典信號轉導通路，但是對于血小板上eNOS的活性調控信號通路的研究少有報導。 Pyridoxine是維生素B6的有效生物成分，在人體多種代謝過程中都起著很重要的作用。現階段的研究發(fā)現其具有降低血液中高同型半胱氨酸濃度，以及

5、抑制血小板聚集等多種功效。Pyridoxine一直以來被認為是一種輔酶參與代謝過程.最近研究發(fā)現，pyridoxine可能通過eNOS途徑抑制低密度脂蛋白對于血管內皮的損害，但pyridoxine是否可能在血小板上通過eNOS調節(jié)血小板功能，目前尚無相關報導。 本文的研究的目的是模擬體內AGEs損傷血小板加速血小板聚集，加快血管病變的進程，觀察pyridoxine是否能抑制AGEs對血小板的損傷，測定血小板上eNOS活性和表達、

6、cGMP水平(NO生物活性的檢測指標)。用Western blotting檢測eNOS Ser<'1177>狀態(tài)以及與信號通路P13k/Akt的關系研究pyridoxine可能的保護機制。首先觀察了pyridoxine對于血小板聚集率的影響。結果顯示：pyridoxine呈濃度依賴性抑制血小板聚集率，當濃度達2 mmol/L時，其抑制聚集率的能力不再隨濃度增加而增加。因此，選取2 mmol/L作為有效保護濃度進行進一步的研究，發(fā)現pyr

7、idoxine可以逆轉AGEs(200mg/L)所引起的血小板聚集，首先從功能方面證實pyridoxine能抑制AGEs的損傷作用。第二步，本研究用Western blotting的方法檢測eNOS的表達及其磷酸化、糖基化的狀態(tài)。結果發(fā)現：pyridoxine可以增加eNOS的磷酸化水平，降低糖基化水平，并能pyridoxine可以抑制AGEs降低eNOS的磷酸化的作用。但是pyridoxine和AGEs對于eNOS總蛋白表達是沒有影響

8、的。用放射免疫的方法檢測cGMP(NO生物活性檢測指標)，結果顯示pyridoxine可以增加cGMP的濃度，并且能抑制AGEs對cGMP濃度降低的作用，說明pyrldoxlne和AGEs是通過改變eNOS的磷酸化狀態(tài)從而使NO的生成量發(fā)生相應的變化，進而對血小板聚集率產生相應的影響。最后又利用Westernblotting等方法驗證eNOS與信號通路P13k/Akt的關系。結果顯示AktSer<'473>狀態(tài)產生相應的改變，并且加入P