乙型肝炎病毒蛋白對肝細胞炎性反應及調(diào)控機制研究.pdf

1、天然免疫反應系統(tǒng)在抵抗乙型肝炎病毒(HBV)感染中發(fā)揮重要作用。作為肝臟最主要的組成，肝細胞在肝臟免疫調(diào)控中可能發(fā)揮了主導作用。本課題研究了HBV蛋白表達對肝細胞/肝癌細胞炎性反應的調(diào)控及其作用機制，為闡明HBV蛋白與肝細胞在肝臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供了研究基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、構(gòu)建HBV蛋白表達重組載體，轉(zhuǎn)染肝細胞/肝癌細胞。通過熒光PCR研究肝細胞/肝癌細胞內(nèi)炎性效應分子在轉(zhuǎn)錄水平上的表達變化趨勢，利用酶聯(lián)免

2、疫吸附試驗(ELISA)和免疫印跡試驗(Western Blot)來研究炎性效應分子在蛋白水平的表達變化情況;
　　2、利用Western Blot和免疫熒光試驗，借助特異的信號通路抑制劑，研究HBV蛋白引起的炎性效應中涉及到的信號通路及其作用;
　　3、構(gòu)建HBV核心抗原(HBc)穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株，檢測HBc在細胞增殖中的作用;
　　4、轉(zhuǎn)染siRNA研究肝癌細胞內(nèi)HMGB1在HBc促細胞增殖過程中的作用，結(jié)合Wester

3、n Blot技術(shù)，研究涉及到的信號通路。
　　結(jié)果：
　　1、HBV大蛋白(LHBs)和HBc能夠上調(diào)AIM2、IL-1β、IL-18、IL-6和TNFαmRNA等炎性基因的表達;中蛋白(MHBs)能夠上調(diào)AIM2、IL-6和TNFα mRNA的表達;小蛋白(SHBs)除引起TNFα表達量上調(diào)外，對其它基因的表達無影響。在SMMC-7721、L-02和Huh7細胞中，LHBs、HBc和MHBs組IL-6表達量上調(diào)且在24小時

4、達到高值。在HepG2和SMMC-7721細胞中，MHBs和HBc組TNFα表達量在轉(zhuǎn)染6小時時達到高值，隨后下降，在Huh7和L-02細胞中，變化趨勢與此相反。在Huh7細胞中，MHBs上調(diào)HMGB1的表達，且在24小時達到高值，在L-02和SMMC-7721細胞中，隨時間延長，MHBs組HMG1的表達量逐漸下降;
　　2、MHBs激活MAPK p38/NF-κB以促進IL-6的表達和分泌，這種效應依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力;在Huh7細

5、胞中，MHBs活化NF-κB來上調(diào)HMGB1的表達，且引起HMGB1從細胞核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì);
　　3、HBc通過激活MAPK p38、ERK1/2和NF-κB來促進IL-6的表達和分泌，但此效應與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力無關(guān);在Huh7細胞中，HBc激活NF-κB以促進HMGB1的表達，但不會引起HMGB1從細胞核到胞質(zhì)的移位;HBc促進Huh7細胞的增殖，HMGB1 siRNA抑制HBc的促增殖作用，同時也抑制HBc對ERK1/2的激活，但對MA

6、PK p38信號通路無影響。
　　結(jié)論：
　　1、同一HBV蛋白在不同細胞株中引起的效應不一致，同一細胞株對不同HBV蛋白的反應也不同?？傮w來說，LHBs、MHBs和HBc會引起炎性基因表達的變化;除TNFα外，SHBs對肝細胞/肝癌細胞內(nèi)其它炎性基因的表達無顯著影響;
　　2、MHBs誘導產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，激活p38/NF-κ B通路，上調(diào)IL-6的表達與分泌，增強HMGB1的表達，并導致其從核轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)，表明，MHB