慢性乙型肝炎患者肝細胞中調控HBV復制基因的篩選及作用機制研究.pdf

1、第一部分慢性乙型肝炎患者宿主肝細胞中調控HBV復制基因的篩選。方法：入選慢性HBV感染患者83例，其中免疫耐受期22例、免疫清除期(HBeAg陽性慢性乙型肝炎)25例、免疫激活期(HBeAg陰性慢性乙型肝炎)25例、非活動免疫控制期11例，并入選6例健康受試者；慢性乙型肝炎診斷標準符合中華醫(yī)學會感染病學分會及肝病學分會2005年制定的《慢性乙型肝炎防治指南》中的診斷標準。超聲引導下經(jīng)皮肝穿刺活檢術獲取肝組織，采用Affymetrix R

2、NA芯片，分析不同臨床階段慢性HBV感染患者肝組織的基因表達譜；為了降低免疫因素的影響，我們主要觀察免疫耐受期和免疫控制期的不同慢性HBV感染狀態(tài)下肝組織基因表達差異。結果：與免疫耐受期患者比較，非活動免疫控制期患者肝組織有109個基因的表達存在顯著統(tǒng)計學差異(p<0.01)，其中54個基因的表達明顯上調，55個基因的表達明顯下調。結論：慢性HBV感染各臨床階段肝組織基因表達存在差異性。其中，非活動免疫控制期與免疫耐受期相比，有109個

3、基因的表達存在顯著差異。
　　 第二部分在不同肝癌細胞系體外模型中利用小RNA干擾技術沉默特異性基因的表達，用southern blot和ELISA驗證差異基因沉默后對HBV復制的影響。方法：在穩(wěn)定表達HBV的肝癌細胞系HepG2.2.15中，分別轉染針對109個基因的特異性小干擾RNA后，用Southern blot檢測胞內(nèi)HBV復制中間體、CMIA法檢測上清液中HBsAg及HBeAg抗原分泌的水平；同時將具有復制能力的HBV

4、感染性克隆和siRNA瞬時共轉染Huh7肝癌細胞系，同法觀察這些基因在瞬轉模型中對HBV復制的調控作用。結果：沉默部分差異基因的表達后，HepG2.2.15或Huh7瞬轉模型中HBV的復制水平出現(xiàn)明顯上調或下調。結論：穩(wěn)定轉染和瞬轉HBV感染細胞模型證實前述差異表達基因可影響HBV復制，其中大部分宿主肝細胞基因與HBV復制的關系乃首次發(fā)現(xiàn)。
　　 第三部分進一步在體外驗證前述研究發(fā)現(xiàn)的對HBV復制影響顯著的4個代表性基因(FAM

5、176A，HIGD1A，MARVELD3和TOMM34)對HBV復制的調控效應和可能機制。方法：分析慢性HBV患者肝組織內(nèi)FAM176A，HIGD1A，MARVELD3和TOMM34的表達水平與患者血清中HBV DNA載量的相關性；在穩(wěn)定表達HBV的肝癌細胞系HepG2.2.15中轉染不同濃度梯度的小干擾RNA后，用Southern blot檢測HBV復制中間體水平、CMIA法檢測細胞培養(yǎng)上清HBsAg和HBeAg，用Western b

6、lot檢測胞內(nèi)核心抗原的水平和核衣殼形成的變化以了解是否在轉錄后水平影響HBV的復制。在Huh7細胞系中共轉染FAM176A，HIGD1A，MARVELD3和TOMM34表達質粒和可復制的HBV克隆，同樣應用上述方法檢測過表達該基因后對HBV的復制以及病毒蛋白表達的影響。觀察過表達質粒和HBV克隆共轉染后對HBV復制影響的劑量依耐性。luciferase熒光素酶活性檢測來觀察4個基因和HBV的啟動子的直接相互作用。結果：FAM176A，

7、HIGD1A和TOMM34的肝內(nèi)表達水平與病人血清中HBV DNA水平呈負相關，而MARVELD3的肝內(nèi)表達與患者血清中HBV DNA水平呈正相關。在HepG2.2.15細胞系中轉染針對FAM176A，HIGD1A，MARVELD3和TOMM34的特異性siRNA可以促進HBV的復制和抗原HBsAg及HBeAg的表達；而在Huh7瞬轉模型中過表達這些基因可明顯抑制HBV復制，并呈明顯的劑量依賴性；沉默MARVELD3的表達能促進HBV核