腫瘤微環(huán)境響應的膜包被納米凝膠介導聯合療法抗腫瘤研究.pdf

1、目的:在近年對聯合療法的研究中，結合化療和免疫療法的策略展現出增強的抗腫瘤效果，引起人們對化療免疫療法的高度關注。然而，化療與免疫治療物質的理化性質和作用機理差異較大，想要控制聯合藥物的劑量與釋放特性，合理的藥物遞送系統(tǒng)就顯得非常重要。
　　方法:在本項研究中，構建了一種具有腫瘤微環(huán)境響應特性的膜包被納米凝膠，其核心由兩種具有不同電荷的殼聚糖（Chitosan）衍生物和羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）衍生物交聯組成，用于包載疏

2、水化療藥物紫杉醇（PTX）。另外，在外部包裹紅細胞膜（RBCm），實現對細胞因子白介素-2（IL-2）的吸附。雙鍵化兩性殼聚糖CECm和季銨化殼聚糖HTCCm通過核磁共振氫譜（1H NMR）和傅利葉變換紅外光譜（FT-IR）確認結構。通過1H NMR確證羥丙基-β-環(huán)糊精丙烯酸酯（HP-β-CD-A）結構。通過濁度滴定法，對處方中CECm、HTCCm和HP-β-CD-A的比例進行摸索。制備載PTX納米凝膠（NGP），與紅細胞膜擠壓后，得

3、到載PTX膜包被納米凝膠（NRP）。將NRP與IL-2孵育，構建PTX和IL-2共包載的膜包被納米凝膠（NRP+I）。通過透射電子顯微鏡（TEM）和動態(tài)光散射（DLS）驗證紅細胞膜包被結構。分別通過HPLC和ELISA對PTX和IL-2的裝載效率進行檢測。通過TEM和DLS的觀測，對NR的pH響應能力進行評價。同時研究載體的穩(wěn)定性與生物相容性。檢測NR在體外和腫瘤微環(huán)境中的pH響應釋藥特性，并對釋放后IL-2的活性進行驗證。然后對NR中

4、PTX和IL-2的藥代動力學和體內分布進行研究。結合小鼠黑色素瘤模型，對化療免疫療法中PTX的最佳劑量進行探索，并以此最佳組合劑量進行后續(xù)實驗。借助腫瘤抑制實驗與單藥組和其他聯合藥物組進行對比。借助免疫熒光切片，對腫瘤中CD8和CRT分子的表達進行檢測。此外，對小鼠主要臟器和血生化進行指標，評估體內生物安全性。借助免疫組化，對腫瘤CD45、CD8和FOXP3分子進行檢測，并通過流式細胞儀對腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的浸潤進行研究，同時對腫瘤中

5、細胞因子水平進行評估。不僅如此，將DiR吸附于NRP+I載體膜層（NRP+I+D），以將光熱療法與化療免疫療法進行結合。通過透射電鏡和紫外光譜對DiR的吸附進行研究。隨后對載體聯合組的體內外升溫效率進行評價。通過腫瘤抑制實驗對熱療與化療免疫聯合載體組的腫瘤抑制效果進行研究，并通過流式細胞儀對腫瘤近端與遠端淋巴結中免疫細胞進行檢測。除熱療外，還將一氧化氮供體（TNO3）與化療免疫療法聯合，對其抗腫瘤和激活免疫細胞的作用進行研究。
　

6、　結果:成功合成了CECm、HTCCm和HP-β-CD-A，并確定以質量比5:1:1制備納米凝膠核心。TEM和Triton X-100實驗證實了NRP+I的膜包被結構。NRP+I中PTX和IL-2的包封率經檢測分別為73.5±2.2％和89.3±5.4%。同時NR展現出良好的腫瘤微酸環(huán)境響應能力。此外，NR還具有良好的體外穩(wěn)定性和低毒性。在pH7.4條件下，PTX和IL-2的釋放比較緩慢，而在pH6.5環(huán)境下，它們的釋放速度明顯加快。除

7、此之外，NR可以明顯增強藥物在腫瘤中釋放與穿透。并且釋放后IL-2的生物活性沒有受到明顯影響。在藥代動力學研究中，PTX和IL-2的體內循環(huán)時間和半衰期都有明顯的延長。體內分布實驗進一步表明，NR可有效遞送藥物至腫瘤部位。此外，劑量探索實驗結果表明，IL-2劑量為2.5μg/kg時，聯合4mg/kg的PTX可發(fā)揮最強腫瘤抑制效果。與NGP+I和其他給藥方案相比，NRP+I都表現出顯著提升的抗腫瘤效果。免疫熒光切片分析顯示，經NRP+I治

8、療后，腫瘤邊緣和深部CRT與CD8的表達被明顯增強。此外，根據主要器官H&E切片的觀察和血生化指標的分析可知，NR介導的化療免疫療法沒有引起明顯毒副作用。經過免疫組化觀察，腫瘤中免疫細胞（CD45）和CD8細胞的浸潤被明顯增強，同時FOXP3細胞數量明顯減少。流式細胞術進一步分析表明，NRP+I促進了引流淋巴結和腹股溝淋巴結中DC的熟化。此外，腫瘤中DCs、輔助性T細胞、細胞毒性T細胞（CTLs）和自然殺傷（NK）細胞的激活與浸潤被明顯

9、增強，活化CTLs/Tregs的比例得到明顯提升。與其他組相比，NR介導化療免疫療法增加了腫瘤中免疫刺激性細胞因子（IFN-γ和IL-12）的水平，同時也抑制了免疫抑制性細胞因子（TGF-β和IL-10）的分泌。然后，在熱療與化療免疫聯合治療部分，透射電鏡和紫外光譜的結果表明DiR可高效吸附于膜層，并且不會明顯影響載體結構。經過2W/cm2808nm的激光照射（NIR）后，NRP+I+D+NIR在體內外都表現出明顯增強的升溫效果。腫瘤抑

10、制實驗結果表明，NRP+I+D+NIR可明顯減小腫瘤體積，延長小鼠生存期，延緩腫瘤復發(fā)。此外，NRP+I+D+NIR治療后，腫瘤近端和遠端淋巴結中DCs的熟化程度和數量都得到明顯提升，輔助性T細胞和細胞毒性T細胞的數量也得到增加。雙瘤模型實驗結果表明，光熱療法可增強遠端未治療腫瘤的抑制效果?？偟膩碚f，光熱療法與化療免疫療法結合，可能增強抗腫瘤效果，增加近端和遠端淋巴結中免疫效應細胞的數量。此外，NO供體聯合療法中，化療免疫療法的腫瘤抑制

11、效果被進一步提升，腫瘤中熟化DC、CD3+CD4+、CD3+CD8+和NK細胞的比例明顯提升。
　　結論:綜上所述，本研究利用羥丙基-β-環(huán)糊精和兩種帶不同電荷的殼聚糖衍生物，構建了一種腫瘤微環(huán)境pH敏感的紅細胞膜包被納米凝膠。此納米載體可以在不影響藥物生物活性前提下實現PTX和IL-2的高效裝載，延長藥物體內循環(huán)時間，增強藥物在腫瘤部位的穿透。其介導的化療免疫療法可明顯增強抗腫瘤效果，促進抗腫瘤免疫效應，調節(jié)免疫抑制性微環(huán)境。通