針對HER2陽性人源胃癌細胞的CAR T細胞治療的體外及體內(nèi)實驗研究.pdf

1、背景:胃癌作為我國常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，在WHO官方公布的2012年度統(tǒng)計中位列全國所有死亡原因的第6位，據(jù)中國國家癌癥登記中心的最新公布數(shù)據(jù)顯示，胃癌在男女兩性癌癥致死率排位中居第3位。由于早期診斷率偏低，我國的胃癌新發(fā)病例確診后多為進展期胃癌，而在其治療上仍是以根治性手術(shù)輔以術(shù)后化療、放療等綜合治療手段為主。伴隨著免疫學和生物工程技術(shù)的不斷發(fā)展，近年來嵌合性抗原受體(CAR)T細胞治療作為過繼性免疫治療的一種新方法，在臨床治療部分

2、血液系統(tǒng)惡性腫瘤中取得了成功，因而將其引入胃癌的免疫治療也成為一種新選擇。我們通過篩選胃癌細胞腫瘤相關(guān)抗原后，HER2作為其細胞膜表面抗原之一被用作CAR的靶抗原，引導T細胞直接和間接殺傷腫瘤細胞。同時通過基因改造的T細胞分泌hIL-12來調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境,輔助誘導其他免疫細胞、細胞因子發(fā)揮免疫殺傷作用，從而有效抑制腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移。
　　目的:以實驗室前期相關(guān)技術(shù)工作為基礎(chǔ)，構(gòu)建可穩(wěn)定表達HER2靶向性CAR和分泌hIL-12的慢

3、病毒骨架質(zhì)粒，通過三質(zhì)粒慢病毒體系制備病毒并轉(zhuǎn)染由人體外周血分離、培養(yǎng)的T細胞，將其回輸?shù)胶闪鲂∈篌w內(nèi)，觀察不同組合T細胞的抗腫瘤作用。
　　方法:1.構(gòu)建HER2靶向性嵌合性抗原受體、hIL-12目的基因的2個基因序列，并將它們分別插入pVAX載體以構(gòu)建新質(zhì)粒，再分別感染293T細胞后，用流式細胞儀檢測CAR序列在細胞膜和細胞內(nèi)的表達，用ELISA試劑盒檢測細胞上清中hIL-12濃度。2個基因序列均送DNA測序驗證完整性。

4、>　　2.將HER2嵌合性抗原受體、hIL-12目的基因的2個基因序列分別插入pWPT-GFP載體以構(gòu)建慢病毒骨架質(zhì)粒，再將其與輔助包裝質(zhì)粒psPAX2、PMD2.G構(gòu)成三質(zhì)粒慢病毒體系制備病毒上清，再分別感染293T細胞后，用流式細胞儀檢測CAR序列在細胞膜的表達，用ELISA試劑盒檢測細胞上清中hIL-12濃度。2個基因序列均送DNA測序驗證完整性。
　　3.利用健康成人外周血分離、培養(yǎng)T細胞，利用前期成功構(gòu)建的三質(zhì)粒慢病毒體

5、系制備病毒上清，用其感染T細胞后，用流式細胞儀檢測CAR序列在細胞膜的表達，用ELISA試劑盒檢測細胞上清中hIL-12濃度。
　　4.用流式細胞儀檢測不同胃癌細胞系HER2表達情況，選擇不同表達強度的胃癌細胞系分別與CART細胞共培養(yǎng)，用ELISA試劑盒檢測上清中IFN-γ、IL-2的濃度;用CytoTox96非放射性細胞毒性檢測試劑盒檢測乳酸脫氫酶釋放以評估CART細胞對HER2表達不同水平胃癌細胞的殺傷效果。
　　5.

6、選擇NCI-N87胃癌細胞以皮下注射的方式構(gòu)建小鼠胃癌模型，采用隨機分組方式分組后接受普通T細胞、CART細胞、CART細胞聯(lián)合分泌hIL-12目的基因T細胞回輸，觀察小鼠瘤體體積變化及有無不良反應(yīng)，最后處死小鼠并記錄瘤體體積和重量。
　　結(jié)果:1.成功構(gòu)建了HER2靶向性嵌合性抗原受體、hIL-12目的基因的2個基因序列，并將其構(gòu)建成pVAX-CAR、pVAX-hIL-12質(zhì)粒并進行目的基因測序，將2種質(zhì)粒分別感染293T細胞后

7、，通過F(ab')2片段檢測CAR陽性率可達到46.23％，通過CD3zeta片段檢測時有陽性表達，陽性率可達37.79％，血清中hIL-12濃度為40.95±1.19pg/ml。
　　2.成功構(gòu)建了pWPT-CAR、pWPT-hIL-12慢病毒骨架質(zhì)粒并進行目的基因測序，分別與輔助包裝質(zhì)粒psPAX2、PMD2.G構(gòu)成三質(zhì)粒慢病毒體系割備病毒上清，成功地分別感染293T細胞，通過F(ab')2片段檢測pWPT-CAR病毒上清濃縮

8、液滴度1.78×108TU/ml，血清中hIL-12濃度最高可達100.80±9.02pg/ml。
　　3.檢測胃癌細胞系HER2表達結(jié)果顯示NCI-N87為強陽性，AGS僅次于NCI-N87，SGC7901和MGC803為中等陽性，MKN45和BGC823為弱陽性。
　　4.從健康成人外周血中分離單核細胞后誘導增殖，CD3+細胞達到95％以上，用上述構(gòu)建的三質(zhì)粒慢病毒體系感染T細胞后，CD3+F(ab')2+淋巴細胞可占到

9、70％以上，細胞上清液中hIL-12濃度為56.59±7.48pg/ml。
　　5.制備的CART細胞可以識別HER2+胃癌細胞并產(chǎn)生直接殺傷作用，且隨著E/T升高而增強，同時可檢測到大量細胞因子IFN-γ、IL-2的釋放，對HER2-或低表達胃癌細胞則無此作用。
　　6.建立Balb/c-nu小鼠胃癌腫瘤模型成功后，觀察普通T細胞、CAR T細胞、CART細胞聯(lián)合分泌hIL-12目的基因T細胞回輸前后的小鼠移植瘤生長變化，

10、證明CART細胞和CART細胞聯(lián)合分泌hIL-12目的基因T細胞治療組均可抑制腫瘤生長，普通T細胞治療組無法有效抑制腫瘤生長。小鼠回輸細胞后未見嚴重不良反應(yīng)。
　　結(jié)論:本研究構(gòu)建HER2靶向性嵌合性抗原受體、hIL-12目的基因序列獲得成功，以此為基礎(chǔ)構(gòu)建的真核細胞表達質(zhì)粒、慢病毒骨架質(zhì)粒均可穩(wěn)定實現(xiàn)轉(zhuǎn)染、表達，構(gòu)建的三質(zhì)粒幔病毒體系可穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外周血中分離培養(yǎng)的T細胞，體外實驗中CAR T細胞可有效識別殺傷HER2+胃癌細胞，并