miR-134與卵巢癌耐藥的關系及其作用機制研究.pdf

1、目的：
　　本課題首先通過體外實驗在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌細胞系分別過表達及抑制miR-134表達，明確其對卵巢癌細胞紫杉醇的敏感性及生物學行為的影響。在前期篩選出Pak2為miR-134靶基因的基礎上，通過免疫組化和Western blot方法在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織中檢測Pak2蛋白表達，證明Pak2蛋白表達與卵巢漿液性癌化療耐藥的關系。通過基因轉(zhuǎn)染和熒光素酶報告基因等技術明確miR-134對Pak2的結(jié)合作用及轉(zhuǎn)

2、錄后調(diào)控;明確miR-134負向調(diào)控Pak2對卵巢癌細胞紫杉醇的敏感性及生物學行為的影響;進一步明確miR-134通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控Pak2基因促進Bad的Ser112及Ser136位點的磷酸化機制。qRT-PCR方法檢測卵巢漿液性癌組織中Pak2 mRNA表達，分析其表達與miR-134表達的相關性。通過免疫組化和Western blot方法檢測化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織中Sirt1蛋白表達情況并證實Sirt1表達與卵巢漿液性癌化療耐

3、藥的關系;在此基礎上應用ChIP、qRT-PCR技術初步明確在化療耐藥卵巢癌細胞中Sirt1對miR-134的結(jié)合及轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)作用。qRT-PCR方法檢測卵巢漿液性癌組織中Sirt1 mRNA表達，分析其表達與miR-134表達的相關性。本研究通過現(xiàn)代分子生物學技術，研究化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織與細胞中miR-134、Pak2、Sirt1表達以及與耐藥的關系，旨在闡明miR-134調(diào)控Pak2在卵巢癌耐藥中的作用，并明確Sirt

4、1調(diào)節(jié)miR-134表達在卵巢癌細胞耐藥形成的重要作用和分子機制，為卵巢癌化療耐藥研究提供新的靶基因和及研究思路。
　　方法：
　　1、MiR-134與卵巢癌耐藥的關系及其作用研究
　　利用qRT-PCR方法檢測miR-134在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織及細胞系中的差異表達。在SKOV3-TR30細胞中通過轉(zhuǎn)染miR-134 mimic外源性升高miR-134表達（miRNA mimic NC為對照組），CCK-8

5、細胞增殖實驗檢測miR-134表達改變前后細胞增殖抑制率的變化;AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡實驗檢測miR-134表達改變前后細胞凋亡能力的變化。研究miR-134在卵巢漿液性癌細胞紫杉醇耐藥中的作用。
　　2、MiR-134調(diào)控Pak2與Pak2磷酸化Bad蛋白在卵巢癌耐藥中的作用及其機制研究
　　通過免疫組化及Western blot方法檢測Pak2在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織和細胞中的表達，分析Pak2表達與

6、卵巢漿液性癌組織化療耐藥的關系及與卵巢癌患者臨床病理特征的關系。構(gòu)建PMIR-Pak2及其突變質(zhì)粒PMIR-Pak2-mut，熒光素酶報告基因方法檢測miR-134對PMIR-Pak2報告基因的結(jié)合抑制作用，qRT-PCR及Western blot方法證明miR-134對Pak2在轉(zhuǎn)錄后水平進行調(diào)控。在耐紫杉醇卵巢癌SKOV3-TR30細胞中轉(zhuǎn)染Pak2 siRNA，紫杉醇作用后，應用CCK-8細胞增殖實驗檢測Pak2抑制表達后細胞增殖

7、抑制率的變化，AnnexinⅤ-FITC細胞凋亡實驗檢測細胞凋亡能力的變化。
　　3、在卵巢癌耐藥中Sirt1轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)miR-134的作用研究
　　免疫組化方法及Western blot方法檢測Sirt1在化療耐藥與敏感卵巢漿液性癌組織和細胞中的表達，分析Sirt1表達與卵巢漿液性癌組織化療耐藥的關系及與卵巢癌患者臨床病理特征的關系。ChIP證明Sirt1對miR-134上游調(diào)控序列具有結(jié)合作用;進一步分別于SKOV3細

8、胞外源性過表達Sirt1、于SKOV3-TR30細胞中抑制Sirt1表達，應用real-time PCR方法檢測轉(zhuǎn)染后miR-134在耐紫杉醇卵巢癌細胞系中表達變化情況。
　　結(jié)果：
　　1、MiR-134與卵巢癌耐藥的關系及其作用研究
　　利用qRT-PCR方法檢測miR-134在卵巢漿液性癌化療耐藥與敏感組織及細胞系中的差異表達。結(jié)果顯示與化療敏感組相比化療耐藥組中miR-134表達顯著降低0.6488±0.202

9、8(P=0.0098)。MiR-134在耐紫杉醇卵巢癌細胞SKOV3-TR30細胞中表達較SKOV3細胞中顯著下調(diào)，將SKOV3細胞中miR-134表達水平定位1，在耐紫杉醇卵巢癌SKOV3-TR30細胞中miR-134顯著低表達為0.3981±0.03562(P=0.003)。SKOV3-TR30細胞轉(zhuǎn)染miR-134mimic后相比轉(zhuǎn)染miRNA mimic NC組miR-134表達顯著升高(P=0.008)。通過在SKOV3-TR

10、30細胞轉(zhuǎn)染miR-134mimic(miRNA mimic NC為對照組)后，CCK-8細胞增殖實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞增殖抑制率的變化。
　　2、MiR-134調(diào)控Pak2與Pak2磷酸化Bad蛋白在卵巢癌耐藥中的作用及其機制研究
　　免疫組化及Western blot方法證明Pak2在化療耐藥卵巢漿液性癌組織和細胞中表達較敏感組織和細胞顯著升高，免疫組化實驗證明Pak2在化療耐藥卵巢漿液性癌組織中以細胞漿表達為主。Pak2表

11、達與卵巢漿液性癌組織化療與卵巢癌患者臨床病理特征無關系。
　　選擇擴增靶基因Pak2 CDS區(qū)與miR-134結(jié)合位點附近序列，并成功構(gòu)建其熒光素酶報告質(zhì)粒命名為pMIR-Pak2及其突變質(zhì)粒pMIR-Pak2mut。SKOV3-TR30細胞共轉(zhuǎn)染miR-134 mimic和pMIR-Pak2（共轉(zhuǎn)染miR-134mimic和pMIR-Pak2-mut為對照組），通過熒光素酶報告基因方法，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-134與pMIR-Pak2

12、后（與pMIR-Pak2-mut相比），熒光素酶報告基因檢測相對熒光值顯著降低（0.6779±0.11083 vs.1.0792±0.6924，P=0.01）。而在共轉(zhuǎn)染miRNA mimic NC與pMIR-Pak2（與pMIR-Pak2-mut相比），熒光素酶報告基因檢測相對熒光值無明顯差異。由此證明miR-134與Pak2 CDS區(qū)的結(jié)合位點及其直接結(jié)合作用。通過分別在SKOV3及SKOV3-TR30細胞中過表達及抑制miR-13

13、4表達，應用real-time PCR及Western blot方法證實miR-134改變后，Pak2 mRNA水平無變化，而在蛋白表達水平改變。在SKOV3-TR30細胞中同時轉(zhuǎn)染miR-134 mimic及pBI-Pak2（轉(zhuǎn)染miR-134mimic及pBI為對照組），通過CCK-8實驗及凋亡實驗，發(fā)現(xiàn)miR-134低表達狀態(tài)下對SKOV3-TR30促進細胞增殖作用及凋亡抑制作用是通過Pak2實現(xiàn)的。通過在SKOV3-TR30細胞

14、中轉(zhuǎn)染miR-134mimic及Pak2過表達質(zhì)粒pBI-Pak2，在SKOV3細胞中轉(zhuǎn)染miR-134 inhibitor及Pak2 siRNA后，Western blot檢測轉(zhuǎn)染前后凋亡通路蛋白Bad、Bad-ser112、Bad-ser136表達結(jié)果提示:Bad-ser112，Bad-ser136蛋白改變與Pak2呈正相關。
　　3、Sirt1轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)miR-134在卵巢癌耐藥中的研究
　　免疫組化方法及Weste

15、rn blot方法檢測Sirt1在漿液性卵巢癌化療耐藥組織中表達較敏感組織中的表達顯著升高，且以胞核表達為主。Sirt1表達與卵巢漿液性癌組織化療與卵巢癌患者臨床病理特征無關系。ChIP方法證實，Sirt1與miR-134啟動子區(qū)具有結(jié)合作用。通過分別在SKOV3及SKOV3-TR30細胞中過表達以及抑制Sirt1表達，qRT-PCR檢測miR-134表達呈相反趨勢。在化療耐藥卵巢漿液性癌組織中Sirt1 mRNA表達顯著高于化療敏感卵

16、巢漿液性癌組織(P=0.032)。Pearson相關性分析結(jié)果顯示30例卵巢癌組織中miR-134與Sirt1 mRNA表達呈負相關，且具有統(tǒng)計學意義(P=0.028)。
　　結(jié)論：
　　1、miR-134在化療耐藥組織和紫杉醇耐藥細胞系中呈低表達且外源性升高miR-134表達可通過抑制細胞增殖促進凋亡逆轉(zhuǎn)卵巢癌細胞紫杉醇耐藥。
　　2、MiR-134轉(zhuǎn)錄后調(diào)控Pak2基因，且Pak2通過促進Bad蛋白ser112和s

17、er36位點磷酸化抑制細胞凋亡而可能參與卵巢癌化療耐藥。Pak2蛋白表達在化療耐藥卵巢漿液性癌組織中顯著升高且與卵巢漿液性癌化療耐藥相關。Pak2 mRNA在化療耐藥卵巢漿液性癌組織中表達與化療敏感卵巢漿液性癌組織中無顯著差異，且與miR-134表達無顯著相關性。
　　3、耐紫杉醇卵巢癌細胞中Sirt1通過轉(zhuǎn)錄水平負向調(diào)節(jié)miR-134表達。Sirt1在化療耐藥卵巢漿液性癌組織中高表達且與卵巢漿液性癌化療耐藥相關。Sirt1mRN