CCL2在帕金森病輕度認知功能障礙中的作用及機制研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行論述：
　　第一章 CCL2在慢性小鼠帕金森病模型中血腦屏障的破壞及神經炎癥中的作用研究
　　目的:構建C57BL/6小鼠慢性帕金森病模型，觀察小鼠認知功能狀況;研究CCL2在PD血腦屏障破壞中的作用，以及Bindarit對血腦屏障的保護作用;并進一步研究CCL2在顱內小膠質細胞增殖、炎癥反應及多巴胺能神經元變性丟失中的作用。
　　方法:33只雄性8周齡C57BL/6隨機分為3組，其中生理鹽水Con

2、trol組10只，MPTP/P模型組10只，Bindarit治療組13只。MPTP/P模型組給予25mg/kg MPTP、250mg/kg丙磺舒腹腔注射;Bindarit治療組給予25mg/kg MPTP、250mg/kg丙磺舒、100mg/kgBindarit腹腔注射;生理鹽水Control組給予等量生理鹽水注射，每周注射2次，連續(xù)注射5周。
　　結果:(1)爬桿實驗結果顯示MPTP/P模型組小鼠從桿頂下降到底部時間較Contr

3、ol組延長（P＜0.05）;曠場實驗結果顯示與Control組相比，MPTP/P模型組小鼠運動距離減少、運動速度下降、中央區(qū)域活動時間減少（P＜0.05）;水迷宮定位航行實驗結果顯示MPTP/P模型組小鼠的逃避潛伏期較Control組有明顯延長（P＜0.05）。(2)伊文思藍實驗結果顯示MPTP/P模型組的伊文思藍滲出量比Control組顯著增多（P＜0.05）;Western blot結果顯示MPTP/P組小鼠腦組織中血腦屏障緊密連接

4、蛋白ZO-1和Occludin的表達量較Control組減少(P＜0.05)，透射電鏡結果顯示MPTP/P模型組小鼠腦微血管內膜有斷裂現(xiàn)象，血管周圍滲出增多，緊密連接破壞。(3) OX42免疫組化結果顯示MPTP/P模型組小鼠腦組織中OX42陽性表達的細胞數較Control組增加。(4) TH免疫組化結果顯示MPTP/P模型組小鼠中腦黑質中TH陽性表達的細胞數較Control組減少（P＜0.05）。(5)Western blot結果顯示

5、MPTP/P組小鼠腦組織中α-synuclein蛋白和caspase-3蛋白表達量較對照組增加(P＜0.05)。(6) TUNEL實驗結果顯示MPTP/P模型組小鼠腦組織中神經元凋亡較Control組增加。(7)液相芯片結果顯示MPTP/P模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-17、IFN-γ、 CCL2含量高于對照組（P＜0.05）;而Bindarit治療組則上述現(xiàn)象均有所改善。
　　結論:(1)C57BL/6小鼠腹腔注射

6、MPTP、丙磺舒，每周注射2次，連續(xù)注射5周，可以制作穩(wěn)定的慢性PD模型，且部分小鼠存在認知功能障礙。(2)CCL2在慢性PD小鼠模型中可能起到破壞血腦屏障，促進腦內小膠質細胞增殖活化、炎癥產生，進而導致多巴胺能神經元死亡的作用。(3)Bindarit在慢性PD小鼠模型中可能起到一定的治療作用。
　　第二章 CCL2促進α-Synuclein介導的小膠質細胞增殖活化及神經元凋亡
　　目的:通過原代小膠質細胞、原代神經元培養(yǎng)，

7、探索CCL2是否促進α-Synuclein(α-Syn)介導的小膠質細胞增殖活化，導致氧自由基、炎性因子產生，進而導致神經元凋亡增加。
　　方法:原代培養(yǎng)的小膠質細胞分離純化后分為6組:分組方法①0ng/ml組、12.5ng/ml組、25ng/ml組、50ng/ml組、100ng/ml組、200ng/ml組，分別給予相應劑量的CCL2處理;分組方法②Control組、CCL2組、α-Syn組、CCL2+α-Syn組、CCL2+α-

8、Syn+CCL2 Ab組、CCL2+α-Syn+BIND組，其中CCL2組:50ng/mlCCL2;α-Syn組:200ng/mlα-Syn; CCL2+α-Syn組:50ng/mlCCL2+200ng/mlα-Syn;CCL2+α-Syn+CCL2 Ab組:50ng/mlCCL2+200ng/mlα-Syn+5ug/mlCCL2 Ab;CCL2+α-Syn+BIND組:50ng/mlCCL2+200ng/mlα-Syn+50nMBin

9、darit。處理24小時后:(1) CCK8法、Brdu法檢測各組小膠質細胞增殖活化情況;(2) Griess試劑檢測各組小膠質細胞培養(yǎng)液中NO含量;(3) ELISA法檢測各組小膠質細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-1β含量;(4)免疫熒光檢測各組小膠質細胞α-Syn表達情況;(5)原代神經元培養(yǎng)，加入各組小膠質細胞培養(yǎng)液，流式細胞法檢測其對神經元凋亡的作用。
　　結果:(1) CCK8法、Brdu法檢測各劑量CCL2組小膠質細胞增

10、殖活化情況，結果顯示50ng/ml組小膠質細胞增殖活化最為明顯，其次為100ng/ml組，這兩組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;第二種分組方法中CCL2+α-Syn組小膠質細胞增殖活化最為明顯，其次為CCL2組，這兩組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而CCL2+α-Syn+CCL2 Ab組和CCL2+α-Syn+BIND組增殖活化細胞相對減少。(2) Griess試劑檢測各劑量CCL2組小膠質細胞培養(yǎng)液中NO

11、含量，結果顯示顯示50ng/ml組小膠質細胞產生NO含量最多，其次為100ng/ml組，這兩組與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);第二種分組方法中CCL2+α-Syn組小膠質細胞產生NO量最多，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，加入CCL2 Ab或者Bindarit后，小膠質細胞產生NO含量相對減少。(3) ELISA法檢測各劑量CCL2組小膠質細胞培養(yǎng)液中TNF-α及IL-1β含量，結果顯示各組與對照組相比差異沒

12、有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;第二種分組方法中CCL2+α-Syn組小膠質細胞產生TNF-α及IL-1β含量最多，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），加入CCL2 Ab或者Bindarit后，小膠質細胞產生TNF-α及IL-1β含量相對減少。(4)免疫熒光法檢測各組小膠質細胞α-Syn表達情況。結果顯示CCL2+α-Syn組小膠質細胞α-Syn表達最多，加入CCL2 Ab或者Bindarit組，小膠質細胞α-Syn表達減少。(

13、5)流式檢測原代培養(yǎng)的神經元各組凋亡情況，結果顯示加入CCL2+α-Syn組培養(yǎng)液的神經元凋亡比率最高，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，加入CCL2 Ab或者Bindarit組，神經元凋亡相對減少。
　　結論:CCL2能促進α-Syn介導的小膠質細胞增殖活化，導致NO等氧自由基、炎性因子如TNF-α及IL-1β等產生增加，進而引起神經元凋亡增加。
　　第三章 CCL2基因多態(tài)性及其血漿、腦脊液水平與帕金森病認知

14、功能障礙關系研究
　　目的:(1)探討廣東省漢族人群中CCL2啟動子區(qū)2518A/G(rs1064211)及其受體趨化因子受體2(CCR2) V64I(rs1799864)基因多態(tài)性與PD及PD認知功能障礙的相關性。(2)對PD及PD-MCI患者的血漿、腦脊液CCL2水平進行檢測，探討血漿、腦脊液CCL2水平與PD、PD-MCI的關系。
　　方法:(1)收集521例PD患者及556例正常對照者全血，采用連接酶檢測反應(LDR

15、)法檢測兩組患者CCL22518A/G(rs1064211)及CCR2 V64I(rs1799864)基因多態(tài)性。其中217例PD患者采用簡易認知功能評估量表(MMSE)、蒙特利爾評估量表(MOCA)、成人韋氏認知功能評估量表(WAIS-RC)、成人韋氏記憶力評估量表(WMS-RC)評估其認知功能。運用R×C卡方檢驗比較兩組基因型分布頻率的差異，方差分析比較PD患者各基因型認知障礙的差異，分析其與PD及PD認知功能障礙的相關性。(2)收

16、集140例PD患者和70例正常對照者血漿，45例PD患者和16例正常對照者腦脊液，再將PD組分為PDCN組和PD-MCI組;采用ELISA法檢測血漿、腦脊液中CCL2水平，比較PDCN組、PD-MCI組和對照組血漿、腦脊液CCL2濃度水平。
　　結果:(1)PD組及正常對照組CCL2及CCR2等位基因和基因型頻率之間不存在差異（P＞0.05）。同時，PD患者中CCL2及CCR2各基因型之間未發(fā)現(xiàn)認知障礙差異（P＞0.05）。(2)

17、 PDCN組和PD-MCI組的血漿CCL2濃度明顯高于正常對照組，且PD-MCI組更高(P＜0.05)。PD-MCI組的腦脊液CCL2濃度相對正常對照組及PDCN組明顯增高（P＜0.05）。
　　結論:(1)在廣東漢族人群中CCL2-2518A/G(rs1064211)及CCR2 V64I(rs1799864)基因多態(tài)性與PD及PD認知障礙可能無相關性。(2) PD患者血漿CCL2水平高于正常對照組，并且PD-MCI組尤為顯著。(