堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子促進(jìn)水牛類胚胎生殖干細(xì)胞形成的初步研究.pdf

1、本研究主要檢測(cè)了堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)在水牛類胚胎生殖干細(xì)胞(EG-like)形成過(guò)程中的作用,并進(jìn)一步利用與bFGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的信號(hào)阻斷劑來(lái)研究PGCs重編程為EG-like細(xì)胞的分子機(jī)制,以期為水牛EG細(xì)胞系的建立提供有意義的指導(dǎo)。
　　 (1)對(duì)水牛類胚胎生殖干細(xì)胞飼養(yǎng)層體系的建立進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn):組織塊法培養(yǎng)獲得的細(xì)胞狀態(tài)優(yōu)于酶消化法,組織塊法更適合水牛胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng);并且細(xì)胞傳至三代,狀態(tài)良

2、好且核型正常率為80％,可用于飼養(yǎng)層的制備;經(jīng)MTT法和Brdu免疫熒光檢測(cè),確定10μg/ml的絲裂霉素C處理水牛胎兒成纖維細(xì)胞3.5h既能有效抑制成纖維細(xì)胞增殖又能保持細(xì)胞良好的狀態(tài);并且能維持水牛胚胎生殖干細(xì)胞至8代。
　　 (2)對(duì)水牛原始生殖細(xì)胞(PGCs)體外培養(yǎng)特征進(jìn)行了研究。結(jié)果表明:分離的PGCs呈圓形或橢圓形,比一般體細(xì)胞大,AP染色陽(yáng)性;體外培養(yǎng)部分PGCs具有能動(dòng)特性;培養(yǎng)4-5d,部分PGCs形成形態(tài)差

3、異的克隆,部分以2個(gè)或3個(gè)PGCs聚集體形式存在。表明體外培養(yǎng)的PGCs具有異質(zhì)性。
　　 (3)對(duì)水牛EG-like細(xì)胞的多能性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明水牛EG-like細(xì)胞表達(dá)AP、SSEA-1等細(xì)胞表面抗原;免疫熒光結(jié)果表明克隆表達(dá)Oct4、Nanog、Sox2、c-Myc等多能性因子;PCR檢測(cè)再次證明克隆表達(dá)Oct4、Nanog、Sox2等多能性因子;體外分化實(shí)驗(yàn)表明克隆經(jīng)懸浮培養(yǎng)能形成擬胚體,進(jìn)一步單層分化可形成成纖維樣

4、、上皮樣、平滑肌樣等細(xì)胞類型。體外培養(yǎng)具有一定的自我更新能力,能擴(kuò)增到8代。
　　 (4)對(duì)bFGF在水牛PGCs重編程為EG-like細(xì)胞過(guò)程中的作用進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)bFGF在EG-like細(xì)胞形成過(guò)程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,隨著bFGF添加濃度的升高(0,10,20,40ng/ml),EG-like細(xì)胞克隆形成數(shù)增多,克隆直徑增大,當(dāng)濃度為20ng/ml時(shí)效果最好。
　　 (5)對(duì)bFGF促進(jìn)EG-like細(xì)胞形成