壬基酚暴露與大鼠非酒精性脂肪肝發(fā)病關(guān)系及機(jī)制.pdf

1、非酒精性脂肪肝（NAFLD）在全球范圍內(nèi)廣泛流行，發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)，且病因不明。為探討環(huán)境因素（壬基酚）和不良生活方式（高脂高糖飲食）在NAFLD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，本課題分為兩部分開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究。第一部分，針對(duì)常規(guī)飼料喂養(yǎng)的SD大鼠，采用灌胃暴露壬基酚（NP）連續(xù)90天，研究NP在環(huán)境暴露濃度下是否可導(dǎo)致大鼠NAFLD發(fā)生；第二部分，針對(duì)高脂高糖飼料喂養(yǎng)的SD大鼠，采用NP連續(xù)90天灌胃，觀察SD大鼠在高脂高糖飲食與NP共同作用下

2、大鼠NAFLD發(fā)生情況，以及探討NP亞慢性暴露是否加重或促進(jìn)高脂高糖飲食所致NAFLD的發(fā)生。并檢測(cè)與肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因、蛋白的表達(dá)，初步闡明NP致NAFLD的機(jī)制。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：NP亞慢性暴露對(duì)肝臟及功能的影響。
　　目的：探討NP亞慢性暴露是否誘發(fā)大鼠非酒精性脂肪肝形成。
　　方法：40只清潔級(jí)SD大鼠（200±20）g，雌雄各半，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：（SCXK（渝）

3、2012-0005））適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后隨機(jī)分成4組，即對(duì)照組（玉米油），低劑量組（0.02μg/kg NP），中劑量組（0.2μg/kg NP），高劑量組（2μg/kg NP）。連續(xù)灌胃染毒90 d，灌胃期間每周稱(chēng)量體重1次，記錄飲食量和飲水量。于第10周末每組大鼠隨機(jī)選取4只進(jìn)行肝臟超聲檢測(cè)，90 d后10％的水合氯醛麻醉后剖殺大鼠，腹主動(dòng)脈取血分離血清用于肝功和血脂檢測(cè)，稱(chēng)量肝臟質(zhì)量并計(jì)算肝體指數(shù)，每只大鼠取肝臟最大葉邊緣內(nèi)側(cè)1 m

4、m處組織3等份，1份固定于10%甲醛用于HE染色、其余2份組織凍存-80度用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因Fas，Srebp1，Ucp2的表達(dá)量，Western blot檢測(cè)c/EBPα、PPARγ表達(dá)。
　　結(jié)果：各NP暴露組體重，攝食和飲水無(wú)明顯差異（P>0.05）。超聲結(jié)果顯示，各組未見(jiàn)均未見(jiàn)明顯脂肪肝改變。HE染色發(fā)現(xiàn)，僅高劑量NP組可見(jiàn)少量肝細(xì)胞脂肪變。肝功和血生化結(jié)果顯示，血清ALT，AST，TC，LDL-C

5、沒(méi)有增加（P>0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示，中，高劑量NP暴露組脂質(zhì)合成相關(guān)基因Fas，Ucp2，Srebp1 mRNA與對(duì)照組表達(dá)均上調(diào)（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示，中、高劑量組脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白c/EBPα、PPARγ相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.05)。
　　結(jié)論：低劑量NP亞慢性暴露未致大鼠非酒精性脂肪肝形成，但可上調(diào)部分肝臟脂質(zhì)合成代謝相關(guān)基因Fas，Ucp2，Srebp1和蛋白c/EBPα、PPA

6、Rγ的表達(dá)。
　　第二部分：NP聯(lián)合高脂高糖飲食致大鼠非酒精性脂肪肝及機(jī)制研究。
　　目的：探討NP亞慢性暴露是否加重高脂高糖飲食所致NAFLD的發(fā)生。
　　方法：40只清潔級(jí)SD大鼠（200±20）g，雌雄各半，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：（SCXK（渝）2012-0005））適應(yīng)性喂養(yǎng)（100%基礎(chǔ)飼料）7天后隨機(jī)分成4組，即高脂高糖飲食對(duì)照組（玉米油），高脂高糖飲食+NP低劑量組（0.02μg/k

7、g），高脂高糖飲食+NP中劑量組（0.2μg/kg），高脂高糖飲食+NP高劑量組（2μg/kg）。實(shí)驗(yàn)期間每周稱(chēng)重1次，記錄飲水、攝食量。第10周末每組隨機(jī)抽取4只大鼠進(jìn)行肝臟彩色超聲檢查，出現(xiàn)強(qiáng)回聲區(qū)可判斷NAFLD模型建立成功。于第12周末對(duì)動(dòng)物進(jìn)行剖殺取材，10%的水合氯醛麻醉后，腹主動(dòng)脈取血分離血清用于肝功和血脂檢測(cè)。稱(chēng)量肝臟質(zhì)量并計(jì)算肝體指數(shù)，每只大鼠取肝臟最大葉邊緣內(nèi)側(cè)1 mm處組織3等份，1份固定于10%甲醛用于HE染色、

8、其余2份組織凍存-80度用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因Fas，Srebp1，Ucp2的表達(dá)量，Western blot檢測(cè)c/EBPα、PPARγ表達(dá)。
　　結(jié)果：高脂高糖飲食對(duì)照及NP暴露全部發(fā)生脂肪肝，第12周高劑量組體重增加（P<0.05），低、中劑量NP暴露組飲水量，中、高劑量飲食量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。超聲結(jié)果顯示，各組均發(fā)現(xiàn)強(qiáng)回聲區(qū)域，提示有脂肪肝形成，且中，高劑量組回聲區(qū)強(qiáng)于對(duì)照組，高劑量組強(qiáng)于

9、低劑量組。HE染色發(fā)現(xiàn)，NP暴露組隨劑量增加大泡性脂肪變肝細(xì)胞逐漸增多。肝功和血生化結(jié)果顯示，高劑量組ALT，AST，TC，LDL-C血清含量均增加，中劑量組TG，TC，LDL-C含量血清含量增加（P<0.05）。RT-PCR結(jié)果顯示，各NP暴露組Fas，Ucp2 mRNA表達(dá)量上調(diào)，中劑量Srebp1表達(dá)上調(diào)（P<0.05）。Western blot結(jié)果顯示，除低劑量NP暴露組PPARγ外，其余各組c/EBPα、PPARγ蛋白相對(duì)表達(dá)