重組新城疫病毒NDV-rAnh-EGFP的構建及其抑制腫瘤效果的研究.pdf

1、癌癥是人類死亡的主要病因。在臨床癌癥治療中,傳統(tǒng)的化療和放療治療療效有限,并具有強烈的毒副作用.促使科研學者尋找新的腫瘤治療手段。應用溶瘤病毒治療腫瘤是近年來發(fā)展非常迅速的一種腫瘤治療策略。新城疫病毒(NDV)為單股負鏈RNA病毒,隸屬副粘病毒科禽副粘病毒屬。NDV能夠選擇性在腫瘤細胞內復制,而對人正常細胞無明顯影響。因此,目前新城疫病毒作為溶瘤病毒正在被廣泛地應用于腫瘤治療。而反向遺傳學操作技術的應用使得通過對病毒基因組的改造進一步增

2、加病毒的療效及安全性成為可能。
　　 新城疫病毒Anhinga株最早是在美國佛羅里達州動物園圈養(yǎng)的鳥類中發(fā)現(xiàn)的,屬于中等毒力株。目前,尚未有Anhinga株應用于腫瘤治療的研究報告。本研究主要探討利用反向遺傳操作技術構建的重組新城疫病毒Anhinga株在癌癥治療中的有效性。首先在HN基因和L基因之間插入了增強型綠色熒光蛋白基因的開放閱讀框,并同時添加了相應的轉錄調控序列GE和GS,最終構成了帶有EGFP基因的NDV全長cDNA。

3、攜帶全長cDNA的轉錄質粒與分別表達核衣殼蛋白、磷酸化蛋白、大聚合酶蛋白的輔助質粒共同轉染能夠穩(wěn)定表達,T7RNA聚合酶的BSRT7/5細胞。拯救得到表達增強型綠熒光蛋白的重組新城疫病毒NDV-rAnh/EGFP首先通過雞胚進行增殖并收獲尿囊液。通過觀察EGFP在NDV-rAnh/EGFP感染的活細胞中(BSRT7/5)的表達情況證實表達外源基因的重組新城疫病毒拯救成功。將NDV-rAnh/EGFP在雞胚中連續(xù)傳代15代,鑒定得知所插入

4、的重組新城疫病毒外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定的表達。在HepG-2細胞中進行的重組病毒增殖實驗表明,外源基因片段EGFP的插入并未對病毒的增殖造成影響。
　　 在體外實驗中,利用MTT方法檢測不同病毒滴度NDV-rAnh/EGFP對幾種腫瘤細胞的抑制作用。結果表明,NDV-rAnh/EGFP可以有效地抑制腫瘤細胞的生長。但是,對于不同腫瘤細胞,抑制效果大不相同。NDV-rAnh/EGFP對腫瘤的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性并且與病毒本身在不同

5、腫瘤細胞中的復制能力有關。
　　 為了在體內試驗中檢測重組NDV-rAnh/EGFP對腫瘤的抑制作用,建立昆明小鼠H22腹水瘤模型和H22皮下實體瘤模型,分別通過腹腔注射和瘤內注射NDV-rAnh/EGFP治療腫瘤,結果表明重組新城疫病毒可以有效延長H22腹水瘤模型小鼠的生存時間,抑制H22肝癌實體瘤生長。
　　 綜上所述,本實驗應用反向遺傳操作技術,成功拯救重組新城疫病毒NDV-rAnh/EGFP株。在體外實驗中證實N