枇杷糖代謝關(guān)鍵酶HXK基因家族生物信息學(xué)分析與功能驗(yàn)證.pdf

1、己糖激酶是參與糖酵解第一步反應(yīng)的不可逆酶，是糖代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶之一，具有催化己糖磷酸化的作用。本研究通過(guò)對(duì)RNA-seq測(cè)序獲得的枇杷己糖激酶基因家族序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，再將已分離克隆出的枇杷HXK基因遺傳轉(zhuǎn)化煙草，然后對(duì)獲得的煙草轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行生理表型分析及糖含量測(cè)定，初步驗(yàn)證了枇杷己糖激酶的分子功能。主要研究結(jié)果如下:
　　采用NCBI、ExPASy、Predictprotein等分析軟件對(duì)RNA-seq測(cè)序獲得的EjH

2、XK基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析。序列分析顯示，7條HXK基因序列均含有完整開放閱讀框，編碼497個(gè)氨基酸;蛋白分析顯示，由它們所編碼的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量均約為53kDa，理論等電點(diǎn)pI在6.1～6.8之間，具有1～2段跨膜區(qū)域，均屬于親水性的穩(wěn)定膜蛋白，無(wú)信號(hào)肽;二級(jí)結(jié)構(gòu)組成均以α-螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲為主，且多肽鏈上存在多個(gè)半胱氨酸殘基位點(diǎn)。蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)均包含核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和同源二聚體界面;具有豐富的蛋白磷酸化結(jié)合位點(diǎn)和蛋白功能位點(diǎn)，

3、預(yù)測(cè)分析兩者均可能通過(guò)蛋白的磷酸化、糖基化、?；鹊鞍追g后修飾方式對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行調(diào)控。
　　利用DNAMAN、MEGA5.0等分析EjHXK基因家族序列同源進(jìn)化關(guān)系顯示，它們之間的同源性達(dá)95％～98％，與木本植物己糖激酶蛋白序列同源性較高，且蛋白功能域較保守。系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析顯示，己糖激酶在單子葉植物和雙子葉植物中聚類分布沒(méi)有明顯的界限，而EjHXK基因與蘋果、中國(guó)白梨及可可樹等木本植物中己糖激酶親緣進(jìn)化關(guān)系接近。

4、r>　　通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化煙草獲得EjHXK轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)其T1代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行生理形態(tài)觀察測(cè)定，分析顯示，與野生型煙草植株相比，過(guò)量表達(dá)EjHXK基因植株提早12～15d開花。利用HPLC測(cè)定分析不同時(shí)期EjHXK轉(zhuǎn)基因煙草葉片糖含量，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草中葡萄糖和果糖含量均隨植株生長(zhǎng)而逐漸增加，當(dāng)達(dá)到花期時(shí)出現(xiàn)最高值，而后隨著植株成熟衰老其含量不斷下降，其中蔗糖含量變化趨勢(shì)不明顯，含量偏低。以野生型煙草作對(duì)照，可發(fā)