桑樹轉(zhuǎn)基因受體系統(tǒng)的建立及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、桑樹(MorusL.)屬多年生雙子葉木本植物，是我國重要的經(jīng)濟(jì)樹種，其葉片是家蠶(BombyxmoriL.)的主要天然飼料。因此，人們以獲取桑葉為主要栽培目的，桑樹也是蠶絲業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。此外，桑樹的藥用價(jià)值近年來也已成為新的研究熱點(diǎn)。 桑樹的轉(zhuǎn)基因研究雖然起步較晚，但已探明桑樹是農(nóng)桿菌的易感樹種。應(yīng)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法已將外源基因?qū)肷潴w內(nèi)，并在其中表達(dá)。迄今為止，成功轉(zhuǎn)入桑樹的外源基因多為抗性基因，如：抗菌

2、肽基因、水稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因等，其他有價(jià)值的基因尤其是具有特殊性狀或高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因轉(zhuǎn)化研究較少。同時(shí)，桑樹轉(zhuǎn)基因也存在著再生體系建立困難，基因型依賴性強(qiáng)，轉(zhuǎn)化效率不高等問題。在前人工作基礎(chǔ)上，本研究從建立桑樹高頻再生體系入手，通過進(jìn)一步優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化因素，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的新的完整遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。并應(yīng)用此遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，成功地將毛白楊生長素內(nèi)運(yùn)載體基因轉(zhuǎn)入桑樹，以期改善其經(jīng)濟(jì)性狀。主要研究結(jié)果如下。 1利用生物信息學(xué)軟件和生

3、物信息數(shù)據(jù)庫資源，對(duì)前期克隆的毛白楊生長素內(nèi)運(yùn)載體基因PtAUX1及其編碼的蛋白PtAUX1進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，PtAUX1成熟肽編碼區(qū)全長1760bp，該序列包含有一個(gè)1431bp的開放讀碼框架，編碼477個(gè)氨基酸；PtAUX1蛋白定位于細(xì)胞膜上，共有9個(gè)強(qiáng)的跨膜區(qū)域；其二級(jí)結(jié)構(gòu)含有豐富的α螺旋和大量的隨機(jī)卷曲區(qū)域，僅有少量的β折疊區(qū)域。同時(shí)發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)Aatrans保守結(jié)構(gòu)域。PtAUX1與12個(gè)蛋白具有較高同源性。其中

4、與Pt×PtLAX1的親緣關(guān)系最近，同源性高達(dá)97％。 2研究了新型植物生長調(diào)節(jié)劑噻重氮苯基脲(Thidiazuron，簡稱TDZ)對(duì)桑樹不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的影響。結(jié)果表明，TDZ對(duì)桑樹幼莖、葉柄和子葉的愈傷組織誘導(dǎo)有極顯著的影響。0.5-1.0mg/L的TDZ可以使幼莖、葉柄和子葉提早2-3d產(chǎn)生愈傷組織；在MS+TDZ0.5mg/L+NAA0.2mg/L培養(yǎng)基上，幼莖、葉柄和子葉可獲得91.6％～100％的愈

5、傷誘導(dǎo)率。TDZ對(duì)桑樹外植體愈傷組織的誘導(dǎo)存在顯著的基因型差異，在供試的4個(gè)桑品種中，陜305誘導(dǎo)效果最好，大10最差。對(duì)所獲得的愈傷組織進(jìn)行不定芽分化誘導(dǎo)，結(jié)果幼莖和葉柄的愈傷組織分化率不到10％，子葉的愈傷組織分化率也只有58％，說明其誘導(dǎo)及分化條件尚需進(jìn)一步探索。 3采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，探討了培養(yǎng)基中TDZ含量、NAA含量、葉位、葉齡及品種對(duì)葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響，同時(shí)研究了BA、IAA及糖類對(duì)愈傷組織分化的影響，篩選得到

6、了桑樹葉片愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化的最佳條件。愈傷組織誘導(dǎo)：葉齡為15-18d的試管苗葉片，培養(yǎng)基為MS+TDZ1.0mg/L+NAA0.2mg/L，果糖2％，瓊脂粉0.6％，pH5.6；不定芽分化：培養(yǎng)基為MS+6-BA3.0mg/L+IAA0.1mg/L，果糖2％，瓊脂粉0.6％，pH5.6。在此條件下，陜305葉片愈傷誘導(dǎo)率為93.8％，不定芽分化率可達(dá)100％，平均分化芽數(shù)5個(gè)。成功建立了桑樹葉片高頻再生系統(tǒng)，此系統(tǒng)再生頻率可達(dá)

7、到93.8％?？股孛舾行詼y定表明，該系統(tǒng)完全可以用于遺傳轉(zhuǎn)化研究。 4通過對(duì)浸染農(nóng)桿菌菌液的濃度、浸染時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)基的pH值和共培養(yǎng)基中AS的添加濃度等5個(gè)影響桑樹遺傳轉(zhuǎn)化效果的主要因素進(jìn)行優(yōu)化，得到了桑樹葉盤轉(zhuǎn)化的最佳條件，建立了完整的桑樹遺傳轉(zhuǎn)化體系。最適葉盤轉(zhuǎn)化體系為：GV3101浸染菌液濃度OD600為0.2-0.3，浸染時(shí)間10-15min，共培養(yǎng)時(shí)間2-3d，共培養(yǎng)基pH值5.4，共培養(yǎng)后直接進(jìn)行抗性篩

8、選。 5應(yīng)用建立的桑樹遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對(duì)陜305和大10兩個(gè)桑品種進(jìn)行了毛白楊生長素內(nèi)運(yùn)載體基因PtAUX1遺傳轉(zhuǎn)化，結(jié)果在大量受體材料中篩選到了9個(gè)株系的Km抗性苗，經(jīng)PCR鑒定、Southernblotting和Northernblotting檢測，證明包括兩個(gè)品種的5個(gè)株系已成功導(dǎo)入PtAUX1基因，并且外源基因在mRNA水平上進(jìn)行了表達(dá)。 6將毛白楊生長素內(nèi)運(yùn)載體基因PtAUX1克隆于pET-28a(+)表達(dá)載體，并