丹參遺傳轉化體系的構建及SmGGPPS和SmKSL的轉基因研究.pdf

1、丹參(Salvia miltiorrhiza)是唇形科鼠尾草屬的多年生草本植物，具有較高的藥用價值，據《神農本草經》中記載丹參干燥的根和莖可入藥。丹參在東亞各國廣泛種植用于治療和預防心腦血管疾病、高血脂和急性缺血性中風，其活性成分包括水溶性和脂溶性兩種。丹參在臨床上應用廣泛使得需求量日益增加，人們開始尋找新的途徑解決資源短缺。如今，通過次生代謝途徑上關鍵酶基因克隆和遺傳轉化研究，提高次生代謝產物的產量逐漸成為藥用植物生物技術的研究熱點，

2、而建立高效的遺傳轉化體系是基因工程研究的前提。農桿菌轉化法作為丹參主要的遺傳轉化方法，其條件逐漸被優(yōu)化。由于丹參毛狀根易培養(yǎng)、生長周期短等優(yōu)越性，毛狀根遺傳轉化體系的優(yōu)化比較完善，而丹參植株遺傳轉化體系優(yōu)化方面的研究較少。本研究通過篩選農桿菌轉化過程中影響轉化效率的因素，最終建立起高效可靠的丹參植株遺傳轉化體系，為進一步利用基因工程技術改良丹參品質奠定了基礎。
　　1.丹參遺傳轉化體系的構建
　　以丹參葉片作為外植體，通過根

3、癌農桿菌介導的遺傳轉化法將攜帶gus基因的pCAMBIA2301轉入丹參外植體中，初步建立起丹參的高效遺傳轉化體系。通過gus基因瞬時表達檢測，探究農桿菌菌株類型、共培養(yǎng)時間、不同類型抗生素及濃度對丹參轉化率的影響。結果表明，以上因素都是農桿菌介導丹參遺傳轉化的重要影響因子。優(yōu)化后的轉化方法是:將組培苗葉片剪成0.5 cm2，于1/2MS重懸液制備的ODλ600=0.6菌液中浸泡30 min，用無菌濾紙吸干菌液并接種于含1 mg/L6-

4、BA和0.5 mg/L2，4-D的MS共培養(yǎng)基上進行3d共培養(yǎng)。共培養(yǎng)后的外植體用無菌水沖洗5遍，無菌濾紙吸干水后轉接到含1 mg/L6-BA、0.5 mg/L2，4-D、400 mg/L特美汀的MS除菌培養(yǎng)基上，除菌培養(yǎng)誘導愈傷組織和幼芽階段需添加50 mg/L卡那霉素進行陽性篩選。篩選出的幼芽接種到含0.2 mg/L IBA的1/2MS生根培養(yǎng)基上，誘導生根和促進植株生長。
　　2.丹參過表達，mGGPPS和SmKSL的轉基因

5、研究
　　根據SmGGPPS和SmKSL的序列信息設計兩端引物，從丹參基因組中擴增目的片段，連接至pMD19-T載體上。用XbaⅠ/SacⅠ對SmGGPPS進行雙酶切，用BamHⅠ/SacⅠ對SmKSL進行雙酶切，插入pCAMBIA2301植物表達載體，最終經過酶切檢測和測序檢測確定目的片段整合到載體上。將含有目的基因的載體通過本研究構建的農桿菌介導轉化法導入植物體中，經過篩選和PCR檢測獲得轉基因幼苗，煉苗后移栽于盆中，經過一段