稻瘟病菌Egh16家族基因的敲除與稻瘟病菌對二穗短柄草的致病性研究.pdf

1、(一)Egh16家族基因的敲除與功能分析
　　 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起水稻的重要病害——稻瘟病,了解其致病機制對稻瘟病菌的防治意義重大。同時,作為絲狀真菌致病機理與分子生物學研究的重要模式,稻瘟病菌有著典型的侵染過程,包括產孢、孢子萌發(fā)和附著孢的分化。稻瘟病菌功能基因的研究可以為其它絲狀真菌的研究提供研究思路。稻瘟病菌侵入前過程,特別是附著孢的分化與形成,已經有很好的研究基礎,但病菌的侵染循環(huán)中仍然

2、有多個環(huán)節(jié)的機制十分不清楚,例如侵入后病菌的定殖、菌絲分化和擴展的機制、各細胞器在侵染中的作用等等。
　　 Egh16是通過差減雜交方法在小麥白粉病菌(Blumeria graminis)中首先發(fā)現的一類在侵入后特異表達的基因。在多種植物病原真菌中都發(fā)現其同源基因,其中包括稻瘟病菌中兩個已知的重要致病相關基因GAS1和GAS2。另外,在鐮刀菌中,其同源基因也在侵入后特異表達。因此,推測Egh16是植物病原真菌中一類參與致病過程的

3、重要的基因家族。通過同源基因檢索,我們在稻瘟病菌基因組中獲到8個Egh16基因(包括GAS1與GAS2)。為了進一步明確Egh16基因家族基因與致病性的關系,包括在附著胞形成、侵入及侵入后生長過程中的作用等,本研究克隆了稻瘟病菌的3個Egh16家族基因MG02253、MG00703、MG09875,運用基因敲除的方法獲得了3個基因的突變體,并初步分析了突變體的表型。結果如下:
　　 1 利用小麥白粉病菌Egh16基因蛋白序列,在

4、稻瘟病菌基因組數據庫中通過blast程序進行同源序列檢索,檢索到8個假設基因(MG02253、MG00703、MG09875、MG03504、MG00992、MG11595、GAS1、GAS2)。序列分析表明,MG02253基因開放閱讀框長度為1067bp,包含、1個內含子,2個外顯子,編碼區(qū)總長度為843bp,編碼280氨基酸殘基的多肽:MG00703基因開放閱讀框長度為1053bp,包含1個內含子,2個外顯子,編碼區(qū)總長度為969b

5、p,編碼322氨基酸殘基的多肽。MG09875基因開放閱讀框長度為925bp,包含1個內含子,2個外顯子,編碼區(qū)總長度為828bp,編碼275氨基酸殘基的多肽。
　　 2 通過構建基因置換載體和兩次ATMT轉化,其中,MG02253基因得到75個轉化子,MG00703基因得到72個轉化子,MG09875基因得到73個轉化子。通過PCR和Southern雜交驗證,每個基因在其中鑒定出6個突變子,每個突變子基因編碼區(qū)的90％被HPH

6、基因所取代。各基因隨機選取2個突變體進行表型分析。
　　 3 通過Southern分析,明確了MG02253、MG00703、MG09875三個基因在Guy11菌株基因組中均為單拷貝。
　　 4 各基因突變子在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與生長速度無明顯改變,包括在N饑餓、C饑餓或高滲脅迫條件下,菌落形態(tài)及生長速度與野生型比較也無明顯改變。
　　 5 將各基因的突變體的孢子懸浮液滴在Terylene膜表面誘導萌發(fā)與附著

7、胞的形成。結果顯示,所有菌株的孢子幾乎全部萌發(fā),突變體與野生型的萌發(fā)速度幾乎無差別,附著孢形成率達到95％以上,且可正常侵入,形成侵染菌絲。
　　 6 各基因突變體與野生型和隨機插入菌株均能產生典型的黃褐色病斑,差別不明顯,且致病能力較一致。
　　 7 各基因突變子在OMA培養(yǎng)基上與2539菌株交配,子囊殼的產生不受影響,不影響稻瘟病菌的有性生殖。
　　 (二)稻瘟病菌對二穗短柄草的致病性研究
　　 作為

8、植物與病原真菌互作研究中模式生物,稻瘟病菌與不同寄主(甚至非寄主)之間的互作及不同互作系統之間的異同,對于明確真菌與植物互作機理以及發(fā)掘新的抗性資源具有積極意義。而到目前,稻瘟病菌與其他寄主的互作研究和應用還相對較少。二穗短柄草(Brachypodium distachyon)是一種新型的禾本科模式植物,對多種重要的植物病原真菌敏感,有望成為稻瘟病菌與寄主互作的研究材料之一。通過探索稻瘟病菌對二穗短柄草的接種與發(fā)病條件,觀察二穗短柄草的

9、發(fā)病特點,并與大麥上的發(fā)病情況進行比較,本研究初步建立了稻瘟病菌對二穗短柄草的接種方法和發(fā)病體系。主要結果如下:
　　 1.在人為接種稻瘟病菌的條件下,二穗短柄草的葉片、葉鞘、莖稈、穗部均可獲病。利用稻瘟病菌分生孢子懸浮液對二穗短柄草苗期進行活體或離體接種,都能引發(fā)典型病斑。
　　 2.與同等條件下的大麥相比,二穗短柄草葉片上病斑的出現時間及發(fā)展速度更接近水稻。同時,二穗短柄草葉片上的接種和發(fā)病條件比水稻更易控制,病斑更