Sox9基因修飾人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：構(gòu)建人Sox9基因慢病毒載體，體外Sox9幔病毒載體轉(zhuǎn)染人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)，觀察Sox9基因轉(zhuǎn)染對(duì)hUC-MSCs生物學(xué)特性的影響，以及經(jīng)Sox9基因修飾的hUC-MSCs在單層培養(yǎng)條件下向軟骨細(xì)胞分化的能力，為軟骨組織損傷及退變性疾病的細(xì)胞學(xué)及基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：通過PCR的方法獲得人Sox9基因編碼區(qū)片段，將該片段克隆入慢病毒載體Pwpxl-MOD中產(chǎn)生Pwpxl-MOD/Sox9，

2、通過酶切測(cè)序鑒定慢病毒載體，將Pwpxl-MOD/Sox9、pRsv-REV、pMD1g-pRRE、pMD2G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝成含有Sox9基因的重組慢病毒。采用酶消化法從人臍帶基質(zhì)中獲取間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞表型鑒定，誘導(dǎo)向成骨、脂肪分化以觀察其多向分化潛能。包裝好的慢病毒體外轉(zhuǎn)染hUC-MSCs，利用熒光倒置相差顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的形態(tài)變化、綠色熒光表達(dá)(GFP)情況，轉(zhuǎn)染后48h確定基因轉(zhuǎn)染效率。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶

3、鏈反應(yīng)(RT-PCR)法及免疫印跡(Western-blot)檢測(cè)Sox9在huC-MSCs中的表達(dá)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)法測(cè)定慢病毒對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。在高密度單層培養(yǎng)條件下，不增加生長(zhǎng)因子、地塞米松等軟骨誘導(dǎo)液，將Sox9基因修飾的hUC-MSCs培養(yǎng)分化21d，RT-PCR、Western-blot、免疫組化及免疫熒光染色、阿利新蘭染色檢測(cè)特異性軟骨細(xì)胞分子標(biāo)志Ⅱ型膠原、Agrrecan的表達(dá)以及蛋白多糖的分泌情況。<

4、br>　　 結(jié)果：酶切、測(cè)序鑒定證實(shí)慢病毒載體Pwpxl-MOD中插人片段為基因Sox9。經(jīng)檢測(cè)包裝好的慢病毒滴度為6.0×107TU/ml；從人臍帶基質(zhì)分離出的hUC-MSCs形態(tài)類似于成纖維樣細(xì)胞，CD29(95.9％)、CD44(96.5％)表達(dá)陽性，CD34(3.O％)、CD45(2.6％)造血干細(xì)胞表型標(biāo)志表達(dá)為陰性。向脂肪及成骨方向誘導(dǎo)培養(yǎng)21d，油紅O染色、堿性磷酸酶染色、Von kossa染色均為強(qiáng)陽性，表明hUC-M

5、SCs具有較強(qiáng)的多向分化潛能。基因轉(zhuǎn)染48h后觀察到較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)，Lenti-GFP-Sox9及Lenti-GFP的轉(zhuǎn)染率均達(dá)到90％以上。RT-PCR、Western-blot檢測(cè)到目的基因Sox9在hUC-MSCs中出現(xiàn)過表達(dá)(P<0.001)，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示轉(zhuǎn)染對(duì)hUC-MSCs的增殖活力無明顯影響(P>0.05)。Sox9基因修飾的hUC-MSCs在單層培養(yǎng)下7d開始出現(xiàn)自發(fā)性的細(xì)胞聚集現(xiàn)象，到14d細(xì)胞集聚明顯增大，2

6、1d左右，有較大的軟骨結(jié)節(jié)形成。而Lenti-GFP及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞無明顯的細(xì)胞集聚現(xiàn)象產(chǎn)生。RT-PCR、Western-blot、免疫組化及免疫熒光染色檢測(cè)到Ⅱ型膠原、Agrrecan有較高水平的表達(dá)，阿利新蘭染色示大量的蛋白多糖的在軟骨結(jié)節(jié)中結(jié)聚。
　　 結(jié)論：1、成功構(gòu)建了含有Sox9基因慢病毒載體。2、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增容易，具有多向分化潛能，易于被外源性基因修飾。2、在單層培養(yǎng)條件下，無生長(zhǎng)因子及其他軟骨誘