人臍帶間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞誘導分化過程中Notch信號的初步研究.pdf

1、目的:
　　探討 Notch信號通路在人臍帶間充質(zhì)干細胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,hUC-MSCs)向軟骨細胞誘導分化過程中的作用。
　　方法:
　　1.hUC-MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定:采用酶消化法從人臍帶中分離hUC-MSCs,體外培養(yǎng)擴增;倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)特征;MTT法制作細胞的生長曲線;流式細胞術分別檢測細胞周期、細胞凋亡和細胞表面標志;

2、茜素紅染色、甲苯胺藍染色和油紅O染色分別檢測細胞成骨、成軟骨和成脂分化能力。
　　2.hUC-MSCs中Notch信號的研究:收集第3代hUC-MSCs,體外誘導其向軟骨細胞分化;甲苯胺藍染色和免疫熒光染色分別鑒定蛋白聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)和Ⅱ型膠原蛋白(Collagen TypeⅡ,COL-2A1),阿利新藍法和羥脯氨酸法分別檢測它們的含量;qPCR分別檢測GAG、COL-2A1以及Notch信號分子

3、Jag-1、PS-1、Notch-1和Hes-1的基因表達水平;Western-Blot檢測Notch-1蛋白的表達水平;流式細胞術檢測細胞周期。
　　3.Notch信號在hUC-MSCs向軟骨細胞誘導分化過程中的作用研究:收集第3代hUC-MSCs,體外誘導其向軟骨細胞分化的同時用不同濃度的Notch信號特異性阻斷劑N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-(S)-phenylglycine

4、t-butyl ester(DAPT)處理;倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)特征;MTT法檢測細胞的增殖能力;甲苯胺藍染色和免疫熒光染色分別鑒定GAG和COL-2A1,阿利新藍法和羥脯氨酸法分別檢測它們的含量;qPCR分別檢測GAG、COL-2A1以及Notch信號分子的基因表達水平;Western-Blot檢測Notch-1蛋白的表達水平;流式細胞術檢測細胞周期。
　　結果:
　　1.酶消化法從人臍帶中分離獲得的細胞體外培養(yǎng)至第3

5、代時,其形態(tài)基本為間充質(zhì)干細胞典型的長梭形,且第4、5代的形態(tài)基本不變;第3代細胞的增殖能力強,生長迅速,約有25.4％的細胞處于分裂的G2/S期,而凋亡率僅為6%;細胞CD13、CD44和CD105的陽性率分別為100%、100%和99.9%,而CD11b、CD34、CD45以及HLA-DR的陰性率分別為0.01%、0.02%、0.01%和0.01%,并具有成骨、成軟骨和成脂分化能力。
　　2.與無添加誘導劑的對照組相比,誘導組

6、的甲苯胺藍染色和免疫熒光染色均呈陽性,且染色隨著時間逐漸加深;在第6天、12天和18天,GAG的含量分別為12.39±1.39μg/ml、18.66±1.88μg/ml、25.91±4.08μg/ml,COL-2A1的含量分別為97.18±9.84μg/ml、117.2±3.75μg/ml、195.64±3.31μg/ml;qPCR結果顯示GAG和COL-2A1的基因表達水平隨著時間也逐漸增加,而Jag-1、PS-1、Notch-1和H

7、es-1的基因表達水平明顯下降(p<0.01);Western-Blot結果顯示Notch-1蛋白的表達隨著時間逐漸下降,而處于分裂靜止G1期的細胞比例逐漸上升,分別為70.9%、77.9%和90%。
　　3.誘導組、DMSO組和各濃度DAPT組的細胞形態(tài)由長梭形逐漸變成接近軟骨細胞的多邊形,MTT結果顯示各組的細胞數(shù)量在第5天達到頂峰;各組的甲苯胺藍染色和免疫熒光染色均呈陽性,且染色隨著時間逐漸加深;各組GAG和COL-2A1的

8、含量測定以及基因表達水平檢測也表明GAG和COL-2A1的表達隨著時間逐漸增加,且在第18天,誘導組、DMSO組以及0.5μM、1μM和5μM DAPT組的GAG含量分別為25.91±4.08μg/ml、26.89±1.31μg/ml、21.13±0.92μg/ml、17.63±0.18μg/ml、16.23±0.32μg/ml,COL-2A1含量分別為195.64±3.31μg/ml、203.42±7.31μg/ml;208.12±1

9、3.65μg/ml、185±1.94μg/ml、139.36±4.63μg/ml;qPCR結果顯示,與誘導組相比,各濃度DAPT組Notch信號分子的基因表達水平都下降;Western-Blot結果顯示誘導組、DMSO組和各濃度DAPT組Notch-1蛋白的表達水平隨著時間下降,且各濃度DAPT組下降更明顯,而各組第18天G1期的細胞比例分別為90%、91.9%、88.5%、87.9%和87%。
　　結論:
　　1.酶消化法

10、從人臍帶中分離獲得的細胞活性好,純度高,生長迅速,增殖旺盛,符合間充質(zhì)干細胞的特征,可用于后續(xù)的實驗研究;
　　2.Notch信號通路存在于hUC-MSCs中,它可保持細胞的增殖活性,一旦誘導hUC-MSCs向軟骨細胞分化,Notch信號表達水平下降;
　　3.本課題中hUC-MSCs向軟骨細胞誘導分化的Notch信號表達水平可能比較適合GAG的表達,但還不是COL-2A1表達的最佳水平,進一步適當降低Notch信號表達水平