人熱休克蛋白HSP70與HBVPreS1相互作用的研究.pdf

1、目的：以HSP70與PreS1的相互作用為基礎，以HSP70參與調控HBV病毒分泌作為研究對象，闡明HSP70在包漿內引導HBV病毒顆粒向細胞膜轉運和分泌的機制，同時為開發(fā)以阻斷HBV分泌的新型抗病毒藥奠定基礎。
　　方法：⑴分子克隆技術構建pW28-HSP70原核表達質粒，在大腸桿菌（Eecherichia coli, E.coli）B834中獲得可溶性上清表達，通過蛋白純化技術純化。分子克隆技術構建HSP70腺病毒，構建穩(wěn)定表

2、達HSP70的肝癌細胞系。⑵構建PreS1截斷片段質粒，獲得GST-PreS1X1, GST-PreS1X2, GST-PreS1X3融合蛋白，Pull down實驗初步探究HSP70與PreS1的結合位點。⑶將PreS1截斷為氨基酸殘基，獲得GST-PreS1Δ1-13, GST-PreS1Δ1-44, GST-PreS1Δ16-27, GST-PreS1Δ21-33,GS T-PreS1-Δ21-47, GST-PreS1Δ31-4

3、7, GST-PreS1Δ41-53融合蛋白，通過微量熱泳動技術（Microscale Thermophoresis，MST）找出在HSP70與PreS1在相互結合中發(fā)揮重要作用的位點。⑷通過定點突變技術獲得HSP70突變體，表達純化突變型蛋白?？兹妇G定磷法檢測野生型及突變型HSP70的ATPase活性。⑸通過qRT-PCR，western blot檢測肝癌細胞系中HBV對HSP70的影響；檢測HSP70對HBV的轉錄及蛋白表達水平的影

4、響。⑹通過qRT-PCR，western blot，ELISA檢測HSP70在HepG2.2.15及AD38細胞系中，對HBV分泌水平的影響。⑺通過高通量測序篩選與HBV分泌相關因子探究HBV分泌相關機制。
　　結果：①pW28-HSP70重組質粒在E.coli中獲得可溶性上清表達。經純化HSP70蛋白純度達85％以上。成功構建pAd-HSP70重組腺病毒，并在HepG2.2.15中穩(wěn)定表達。②獲得純度90%以上的GST-PreS

5、1X1, GST-PreS1X2, GST-PreS1X3融合蛋白， Pull down實驗證實 HSP70蛋白能夠與 GST-PreS1X1, GST-PreS1X2, GST-PreS1X3蛋白分別結合。③PreS1的30-45個氨基酸殘基在與HSP70的結合中起著關鍵作用。④獲得三種突變型 HSP70蛋白，分別為 Mutant-Thr38, Mutant-Thr229, Mutant-Ser300。野生型HSP70蛋白的ATPas

6、e在37℃， tris–HCl(pH8.0)等條件下具有較好的活性。野生型HSP70蛋白ATPase活性顯著高于突變體，其檢測結果具有統(tǒng)計學意義。⑤qRT-PCR結果顯示，HBV可以引起HSP70mRNA水平增高，western blot顯示HBV可以引起HSP70蛋白表達增加；同時HSP70可以抑制HBV的轉錄水平，HSP70降低HBV蛋白表達水平。⑥qRT-PCR，western blot及ELISA結果顯示HSP70在一定程度上增