酵母雙雜交技術(shù)篩選hBex1相互作用蛋白.pdf

1、伊馬替尼(Imatinib)是臨床治療胃腸間質(zhì)瘤(Gastrointestinal Stromal Tumors,GIST)和慢性髓系白血病(Chronic Myelogenous Leukemia,CML)的一線藥物,然而部分患者在獲得一定時(shí)間的緩解期后,由于對(duì)Imatinib產(chǎn)生了繼發(fā)性耐藥,導(dǎo)致病情迅速進(jìn)展。Bex是一類功能尚未闡明的小分子信息轉(zhuǎn)導(dǎo)中介體,在先前的研究中,我們發(fā)現(xiàn)hBex1參與了Imatinib的耐藥發(fā)生過(guò)程.闡明

2、hBex1介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路,對(duì)于明確Imatinib的耐藥機(jī)制,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)分子靶向藥物有著重要意義。
　　 目的:建立酵母雙雜交系統(tǒng),從K562細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選hBex1相互作用蛋白質(zhì),并對(duì)候選蛋白進(jìn)行初步鑒定分析。
　　 方法:1.從pEGFP-C1-hBex1中將hBex1基因開(kāi)放讀碼框架克隆至pGBKT7載體,構(gòu)建pGBKT7-hBex1重組質(zhì)粒,并檢測(cè)質(zhì)粒對(duì)酵母的毒性和自激活活性;2.從K562細(xì)胞中提

3、取RNA,通過(guò)SMART技術(shù)和LD-PCR技術(shù)擴(kuò)增K562細(xì)胞ds cDNA;3.將pGBKT7-hBex1,pGADT7-Rec、ds cDNA共轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母,通過(guò)SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板篩選陽(yáng)性克隆;4.將獲得的陽(yáng)性克隆pGADT7-library質(zhì)粒與pGBKT7-hBex1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母,通過(guò)SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板對(duì)相互作用進(jìn)行驗(yàn)證;5.對(duì)驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序和生

4、物信息學(xué)分析。
　　 結(jié)果:1.構(gòu)建了酵母表達(dá)質(zhì)粒pGBKT7-hBex1,檢測(cè)證實(shí)重組質(zhì)粒對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性作用,無(wú)自激活活性;2.共轉(zhuǎn)化酵母后從SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板篩選出17個(gè)陽(yáng)性克隆,劃線轉(zhuǎn)種平板重復(fù)檢測(cè)篩選出13個(gè)陽(yáng)性克隆;3.13個(gè)陽(yáng)性克隆中提取的pGADT7-library重組質(zhì)粒與pGBKT7-hBex1質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化感受態(tài)酵母,均能在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上生長(zhǎng);4