鹽酸戊乙奎醚對(duì)失血性休克-內(nèi)毒素二次打擊大鼠損傷的保護(hù)作用.pdf

1、失血性休克若治療不當(dāng)或不及時(shí),可作為第一次打擊使機(jī)體處于不同程度的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS),其后感染造成第二次打擊,放大已存在的炎癥狀態(tài)而發(fā)生過度的SIRS,甚至多器官功能障礙綜合征(MODS)。急性腎損傷(AKI)是休克、感染、創(chuàng)傷等誘導(dǎo)MODS發(fā)生過程中常見的病理過程之一,其發(fā)生對(duì)MODS的發(fā)展及預(yù)后具有重要作用。失血性休克使腎血流量明顯減少,尤其腎皮質(zhì)血流減少更顯著,而80％的功能性腎小球位于腎皮質(zhì),這樣就造成了明顯的腎小球

2、濾過率下降及腎功能損傷。腎缺血后,在磷脂酶的作用下,細(xì)胞膜的雙層脂質(zhì)遭到破壞降解,導(dǎo)致腎小管通透性的增加,腫脹的腎小管上皮細(xì)胞阻塞腎小管,從而阻礙了血流的通過,導(dǎo)致腎小球?yàn)V過作用的下降。隨著缺血被糾正,即再灌注后大量的酸性物質(zhì)、以及由于腸屏障功能損傷導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素血癥和腸道細(xì)菌移位進(jìn)入血液。腎缺血缺氧后引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加,形成Ca2+超載。胞漿中Ca2+過多,可激活黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶,從而產(chǎn)生大量氧自由基,使細(xì)胞膜及

3、其結(jié)構(gòu)遭到又一次的損傷,進(jìn)而導(dǎo)致腎功能障礙,炎性介質(zhì)釋放如IL-1、IL-6、IL-8、ICAM—1、TNF-α誘導(dǎo)炎性瀑布,放大炎性反應(yīng),進(jìn)一步產(chǎn)生加重腎損傷。
　　 傳統(tǒng)抗膽堿能藥物具有解痙、改善微循環(huán)、抑制鈣超載和生物膜的脂質(zhì)過氧化,抑制炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和釋放,對(duì)組織細(xì)胞起保護(hù)作用。自20世紀(jì)60年代起被廣泛用于臨床,但因需劑量過大、不良反應(yīng)較多,限制了其臨床應(yīng)用。新型強(qiáng)效抗膽堿能藥鹽酸戊乙奎醚(Penehyclidine

4、hydrochloride,PHC),與傳統(tǒng)抗膽堿能藥相比,具有選擇性M1、M3和N1、N2受體拮抗作用,對(duì)中樞和外周均有很強(qiáng)的抗膽堿作用,而對(duì)M2受體無明顯作用,對(duì)心血管系統(tǒng)干擾小。研究發(fā)現(xiàn)鹽酸戊乙奎醚對(duì)各種原因?qū)е碌募毙苑螕p傷具有保護(hù)作用:用于心臟瓣膜置換術(shù)可明顯減輕心肌缺血再灌注后脂質(zhì)過氧化和過度的炎性反應(yīng),減輕心肌受損的程度；對(duì)缺血再灌注損傷的心、腦、腎等器官均具有保護(hù)作用?？梢?PHC有較好的器官保護(hù)作用,目前,PHC主要用于

5、有機(jī)磷農(nóng)藥中毒的搶救、麻醉前用藥以及感染性休克的救治等方面。
　　 近年來Moore首次提出了二次打擊的概念,認(rèn)為創(chuàng)傷、休克等作為第一次打擊,引起全身炎癥反應(yīng),隨后一個(gè)較小的刺激放大了已存在的炎癥狀態(tài)而引起器官組織損害,甚至發(fā)生MODS。劉健等研究發(fā)現(xiàn),山莨菪堿對(duì)兔失血性休克合并內(nèi)毒素血癥二次打擊所致器官損傷具有一定的保護(hù)作用,但山莨菪堿作用短暫,且不具有選擇性抗膽堿能作用。我們前期研究表明,PHC對(duì)“失血性休克一內(nèi)毒素”二次打

6、擊大鼠肺損傷有保護(hù)作用。本研究,通過觀察不同劑量PHC對(duì)“失血性休克-內(nèi)毒素”二次打擊wistar大鼠血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、腎組織粘附分子(ICAM-1)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的影響以及腎組織病理學(xué)改變,旨在進(jìn)一步觀察PHC對(duì)二次打擊大鼠的腎保護(hù)作用。
　　 材料與方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 健康

7、wistar大鼠45只,雄性,體質(zhì)重180-230g,6-7周齡,由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(許可證號(hào):SCXK粵2006-0015)。
　　 2.動(dòng)物分組
　　 Wistar大鼠45只,隨機(jī)分為五組,每組9只:
　　 ①假二次打擊組(S組)②二次打擊組(M):失血性休克+內(nèi)毒素(LPS)2 mg/kg+0.9％氯化鈉注射液③PHC1 mg/kg組(PHC1組):失血性休克+LPS(2 mg/kg)+PHC(

8、1 mg/kg)④PHC2 mg/kg組(PHC2組):失血性休克+LPS(2 mg/kg)+PHC(2 mg/kg)⑤PHC3 mg/kg組(PHC3組):失血性休克+LPS(2 mg/kg)+PHC(3 mg/kg)
　　 3.二次打擊模型的建立參照FAN[1]等的方法建立二次打擊模型,分首次打擊(失血性休克+復(fù)蘇再灌注)和二次打擊(內(nèi)毒素血癥)兩個(gè)階段。大鼠實(shí)驗(yàn)前晚禁食,自由飲水,次日上午稱重,20％烏拉坦(5 ml/kg

9、)腹腔注射麻醉,仰臥位固定于鼠板上,利用保溫?zé)羰勾笫篌w溫控制于(37+1)℃,無菌操作下行左側(cè)股動(dòng)脈及股靜脈插管術(shù)并用肝素生理鹽水沖洗導(dǎo)管,股動(dòng)脈插管接壓力傳感器監(jiān)測(cè)血壓,血壓穩(wěn)定15min后,開放股動(dòng)脈導(dǎo)管緩慢勻速放血(血液肝素化保存以供回輸),并在15 min內(nèi)使平均動(dòng)脈壓(MAP)降至35+5 mmHg(放血量約占全血量的30％)形成失血性休克,通過間斷放血和股靜脈導(dǎo)管回輸血液維持1h,然后進(jìn)行液體復(fù)蘇,時(shí)間為90 min。先輸入

10、保存的血液,然后輸入1.5倍于血量的乳酸林格液,血壓恢復(fù)到放血前的97％或以上為復(fù)蘇成功。成功30 min后,經(jīng)股靜脈注射LPS2mg/kg(Escherichia coli0111:B4美國Sigma公司)。60 min后,M組經(jīng)股靜脈注射生理鹽水1 ml,PHC1組、PHC2組、PHC3組分別經(jīng)股靜脈注射PHC1、2、3 mg/kg,均稀釋為1ml,S組只行股動(dòng)脈、股靜脈插管不放血。2 h后,股動(dòng)脈采血2 ml,離心取血清于-80℃

11、凍存待檢血清TNF-α、IL-1、IL-8、Cr、BUN含量,放血處死大鼠取腎臟組織放于10％福爾馬林液中固定,免疫組織化學(xué)的方法測(cè)定腎粘附分子(ICAM-1)和核因子-κ3(NF-κB)的表達(dá),HE染色觀察腎的病理改變。
　　 4.指標(biāo)測(cè)定
　　 (1)Liquidchip法測(cè)定血清TNF-α、IL-1、IL-8含量放血處死大鼠時(shí)取動(dòng)脈血液2 ml,靜止30 min后,3000 r/min,4℃,離心15 min,離心

12、后取血清,操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行,使用Lum inex100液相芯片機(jī)血清TNF-α、IL-1、IL-8含量,血清cr、BUN測(cè)定使用南方醫(yī)院檢驗(yàn)科自動(dòng)生化分析儀(Olympus Au5400)。
　　 (2)腎組織病理學(xué)觀察腎組織經(jīng)10％甲醛固定,自動(dòng)脫水,浸蠟,包埋,切片,常規(guī)HE染色。Nikon Eclip Se Ti-S顯微鏡200倍鏡下觀察。
　　 (3)測(cè)定腎組織ICAM-1和核因子-κB采用免疫組

13、織化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè),顯微鏡下觀察組織中ICAM-1和核因子-κB的表達(dá)。依照細(xì)胞陽性著色程度(抗原含量)分為:弱陽性(+)-1分；中等陽性(++)-2分；強(qiáng)陽性(+++)-3分。依照陽性細(xì)胞數(shù)量分為:弱陽性(+,指陽性細(xì)胞總數(shù)在25％以下)；中等陽性(++,指陽性細(xì)胞總數(shù)在25％～49％)；強(qiáng)陽性(+++,指陽性細(xì)胞總數(shù)在50％以上)。采用積分綜合計(jì)量,計(jì)算公式:(+)％×1+(++)％x2+(+++)％×3,總數(shù)值<0.5者為(+)；

14、0.5-1.0者為(++)；1.0-1.5者為(+++)；>1.5者為(++++),至少隨機(jī)觀察5-10個(gè)HPF。
　　 5.采用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)處理,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料方差分析,首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),方差齊采用One-Way-ANOVA方法檢驗(yàn),方差不齊者采用welch檢驗(yàn),組間比較有顯著性差異,多重比較若方差齊采用LSD檢驗(yàn),若方差不齊采用Dunnett T3檢驗(yàn)。等級(jí)資料

15、采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果：
　　 1.血清TNF-α、IL—1、IL-8、Cr、BUN的變化與S組比較,M組與PHC1、PHC2、PHC3各治療組血清TNF-α、IL-1、IL-8、Cr、BUN含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與M組比較,PHC1、PHC2、PHC3各治療組血清TNF-α、IL-1、IL-8、Cr、BUN含量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0

16、.05):與PHCl比較,PHC2與PHC3組血清TNF-α、IL-1、IL-8、Cr、BUN含量較高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05):PHC2與PHC3組血清TNF-α、IL-1、IL-8差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),血清Cr、BUN含量降低(P<0.05)。
　　 2.腎組織ICAM-1和NF-κB的表達(dá)M組ICAM—1主要在腎小球毛細(xì)血管、系膜區(qū)及間質(zhì)大量表達(dá),腎小管中亦有表達(dá),表現(xiàn)為不均勻的棕黃色顆粒狀物；PHC1

17、、PHC2、PHC3組ICAM-1在腎小球毛細(xì)血管、系膜區(qū)及間質(zhì)少量表達(dá),表現(xiàn)為不均勻的淡黃色顆粒狀物；S組基本無陽性表達(dá)。各組間ICAM-1的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。
　　 NF—κB主要在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá),表現(xiàn)為不均勻的黃褐色顆粒狀物,M組表達(dá)顯著；PHC1、PHC2、PHC3組在腎小管上皮細(xì)胞可見少量棕黃色顆粒狀物；S組基本無表達(dá),各組間NF-κB的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.001)。
　　 3.腎組

18、織病理學(xué)的改變M組腎小管上皮細(xì)胞腫脹,核濃縮空泡變性、壞死,管腔內(nèi)可見大量的細(xì)胞管形、蛋白管形及脫落的細(xì)胞,間質(zhì)血管擴(kuò)張、充血、內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤。PHC1、PHC2、PHC3組。腎小管上皮細(xì)胞腫脹明顯減輕,間質(zhì)少許充血及炎細(xì)胞浸潤,S組腎組織結(jié)構(gòu)基本正常。
　　 結(jié)論：
　　 1.PHC可降低“失血性休克-內(nèi)毒素”二次打擊大鼠血清TNF-α、IL-1、IL-8水平,降低Cr、BUN含量,抑制ICAM-1、NF-κB表