出芽短梗霉全細(xì)胞合成普魯蘭及其高效轉(zhuǎn)化機(jī)制研究.pdf

1、普魯蘭（Pullulan）是一種由麥芽三糖經(jīng)α-1,6糖苷鍵聚合而成的微生物多糖，一般由多形態(tài)真菌出芽短梗霉發(fā)酵產(chǎn)生。普魯蘭獨(dú)特的線性結(jié)構(gòu)使其具有典型的成膜性、粘合性、阻氧性和可生物降解等生理特性，因此，在食品、化工、醫(yī)藥和環(huán)保等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　與以往發(fā)酵法生產(chǎn)普魯蘭的方法不同，本論文采用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法合成普魯蘭。以出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans CCTCC M2012259）為出發(fā)菌株，探

2、討該菌株在轉(zhuǎn)化葡萄糖合成普魯蘭的可行性，優(yōu)化種子培養(yǎng)基以提高細(xì)胞合成普魯蘭的能力，研究表面活性劑在促進(jìn)普魯蘭生物合成中的作用，考察金屬離子對(duì)普魯蘭生物轉(zhuǎn)化的影響及其機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　1.采用響應(yīng)面法優(yōu)化種子培養(yǎng)基，以提升A. pullulans CCTCC M2012259細(xì)胞轉(zhuǎn)化葡萄糖合成普魯蘭的能力。首先，采用單因素實(shí)驗(yàn)考察種子培養(yǎng)基中各營(yíng)養(yǎng)組分對(duì)普魯蘭轉(zhuǎn)化能力的影響。在此基礎(chǔ)上，運(yùn)用Plackett-Ber

3、man設(shè)計(jì)篩選出影響普魯蘭轉(zhuǎn)化能力最為顯著的三種營(yíng)養(yǎng)物：葡萄糖、酵母粉和七水硫酸鎂。利用響應(yīng)面分析對(duì)這這三種營(yíng)養(yǎng)物的濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳的種子培養(yǎng)基成分組合：葡萄糖63.97 g/l，酵母粉3.57 g/l，硫酸銨0.6 g/l，磷酸氫二鉀5.0 g/l，氯化鈉1.0 g/l，七水硫酸鎂0.18 g/l。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在優(yōu)化培養(yǎng)基中獲得的細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化葡萄糖合成普魯蘭的能力為32.72 mg/g/h，比原始培養(yǎng)基提高了23.1％。同

4、時(shí)，轉(zhuǎn)化過(guò)程中葡萄糖的消耗速率和普魯蘭的合成速率都比對(duì)照更快，說(shuō)明應(yīng)用響應(yīng)面分析優(yōu)化種子培養(yǎng)基是可行的。此外，對(duì)A. pullulans CCTCC M2012259細(xì)胞中普魯蘭合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平和酶活大小進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，pgm1和fks基因的轉(zhuǎn)錄水平分別比對(duì)照組的上調(diào)了2.5倍和1.2倍，PGM和FKS的酶活性也分別提高了17%和19%，解釋了種子培養(yǎng)基優(yōu)化提高了普魯蘭轉(zhuǎn)化能力的原因。最后，對(duì)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法合成普魯蘭的

5、培養(yǎng)基成分進(jìn)行成本核算，全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法要比發(fā)酵法節(jié)省22.12%。
　　2.考察了不同類型表面活性劑在普魯蘭生物轉(zhuǎn)化中的作用，發(fā)現(xiàn)吐溫和斯潘在普魯蘭生物轉(zhuǎn)化中具有顯著的促進(jìn)作用。在此基礎(chǔ)上，搖瓶轉(zhuǎn)化結(jié)果表明Tween80和Span80在普魯蘭生物轉(zhuǎn)化中具有十分突出的作用，當(dāng)二者濃度分別為5 g/l和20 g/l時(shí)，普魯蘭產(chǎn)量分別比對(duì)照提高了36.10%和38.39%。Tween80和Span80復(fù)配進(jìn)一步提高了普魯蘭的合成量，但并沒(méi)

6、有累加效應(yīng)。研究了表面活性劑提高普魯蘭生物轉(zhuǎn)化效率的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Tween80和Span80對(duì)細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著影響，但提高了細(xì)胞內(nèi)膜的通透性，有效調(diào)控了普魯蘭生物合成途徑中三種關(guān)鍵酶的酶活，并且增加了胞內(nèi)能量物質(zhì)ATP的供給，因而顯著提高了全細(xì)胞合成普魯蘭的產(chǎn)量。
　　3.考察了不同種類的金屬離子在普魯蘭生物轉(zhuǎn)化中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)銅離子可以顯著促進(jìn)普魯蘭生物轉(zhuǎn)化。分別向轉(zhuǎn)化液和種子培養(yǎng)基中添加銅離子，考察其對(duì)普魯蘭轉(zhuǎn)化的影響，

7、結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最適的銅離子添加濃度均為0.2 mg/l，普魯蘭產(chǎn)量分別比對(duì)照（轉(zhuǎn)化液和種子培養(yǎng)基中均未添加銅離子）提高了36.2%和42.3%。在此基礎(chǔ)上，考察了同時(shí)向轉(zhuǎn)化液和種子培養(yǎng)基中添加銅離子時(shí)普魯蘭生物轉(zhuǎn)化的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化至48 h時(shí)，普魯蘭產(chǎn)量比對(duì)照提高了52%，表明在這兩個(gè)過(guò)程中銅離子的添加具有協(xié)同作用，但沒(méi)有累加效應(yīng)。最后，研究了銅離子促進(jìn)普魯蘭生物轉(zhuǎn)化的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)適量的銅離子既不會(huì)影響細(xì)胞的存活率，也不會(huì)導(dǎo)致黑色素的