海洋普魯蘭短梗霉hn6.2菌株鐵載體合成與調控的研究

1、中國海洋大學博士學位論文海洋普魯蘭短梗霉H N 6 ．2 菌株鐵載體合成與調控的研究學位論文完成日期：指導教師簽字：答辯委員會成員簽字：中國海洋大學博士學位論文海洋普魯蘭短梗霉H N 6 ．2 菌株鐵載體合成與調控的研究摘 要普魯蘭短梗霉( A u r e o b a s i d i u m p u l l u l a n s ) H N 6 ．2 菌株由海洋環(huán)境中分離獲得，為一株可高產異羥肟酸類鐵載體F u s i g e n 的海洋

2、酵母。在最優(yōu)條件下，其鐵載體產量最高可達到0 ．4 4 m M ，在培養(yǎng)基中添加F e 3 + 后該菌株鐵載體的產量明顯減少，該菌株所產鐵載體對海洋鰻弧菌和海洋副溶血弧菌具有明顯的抑菌活性。但是目前其他實驗室還未在分子水平上對該菌株鐵載體合成與調控機制進行研究。F u s i g e n 鐵載體的合成途徑起始于L 一鳥氨酸一N 5 ．羥基化，由L 一鳥氨酸．N 5 ．單加氧酶催化，形成N 5 ’羥基L ．鳥氨酸，即鐵載體的基本結構單元。

3、數(shù)個該結構基本單元在非核糖體肽合成酶( N l 沖S s ) 的催化下組裝為鐵載體，所以L 一鳥氨酸．N 5 一單加氧酶催化該鐵載體合成反應的第一步反應。為了研究該酵母菌鐵載體合成和調控的功能基因，本研究構建了該菌株的基因敲除元件。該元件由T E F 啟動子，潮霉素B 磷酸轉移酶基因( 胛丁基因) 和特定終止子序列( p o l y A ) 構成，將該元件命名為p G D M l A P 一1 。在該元件的兩端連接上來自該菌株的蛋白酶基

4、因5 ’．端同源重組片段( 5 ' - a r m ) 和3 ’一端同源重組片段( 3 ' - a r m ) 后得到堿性蛋白酶基因敲除載體，該敲除載體轉化到H N 6 ．2 菌株細胞后，獲得的敲除菌株堿性蛋白酶活性大幅下降，說明基因敲除元件p G D M I A P ．1 在H N 6 ．2 菌株中可以正常起作用，敲除載體構建成功。在本研究中，通過反向P C R 和R T ．P C R 的方法克隆了催化H N 6 ．2

5、 菌株鐵載、-體合成途徑第一步反應的L ．鳥氨酸．N 5 ．單加氧酶( L ．鳥氨酸．N 5 ．羥化酶) 基因，將該基因命名為S i d A ，該基因G e n B a n k 登錄號為F J 7 6 9 1 6 0 。該基因O I 訌長度為1 4 6 1 b p ，無內含子，編碼4 8 6 個氨基酸，推導的蛋白質等電點為7 ．7 9 ，分子量為5 5 4 2 1 。該基因上游啟動子包含一個C A A T 盒和兩個轉錄抑制因子結合位點G