禽（雞）呼腸孤病毒σB編碼基因的原核表達(dá)及重組抗原ELISA診斷試劑盒的研制.pdf

1、禽呼腸孤病毒(Avian reovirus，ARV)是呼腸孤病毒科，正呼腸孤病毒屬的成員之一。ARV在臨床上主要引起雞的關(guān)節(jié)炎/腱鞘炎。其造成患雞生長(zhǎng)抑制、免疫功能降低、繼發(fā)感染增加等，給養(yǎng)雞業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。ARV共編碼15個(gè)蛋白，其中σ B蛋白是由S3基因編碼，是病毒的外殼蛋白之一，具有提高感染細(xì)胞的能力，并在病毒的致病機(jī)理上起著一定的作用。本試驗(yàn)利用基因克隆技術(shù)體外表達(dá)σB蛋白并應(yīng)用表達(dá)的融合蛋白作為抗原建立ELISA檢測(cè)技術(shù)

2、。 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的ARVσB序列，設(shè)計(jì)合成了一對(duì)特異性引物，對(duì)ARV 99G株的S3基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增一段1100bp的基因片斷，然后克隆到表達(dá)載體pGEX-6p-1中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌，經(jīng)終濃度為1 mmol/L的1PTG誘導(dǎo)，高效表達(dá)了σB蛋白。經(jīng)Western-blot檢測(cè)表明，表達(dá)的融合蛋白能夠被ARV的陽性血清所識(shí)別，具有良好的抗原性。 用純化后的原核表達(dá)的ARVσB蛋白作為診斷抗

3、原，建立了檢測(cè)ARV抗體的間接ELISA方法，并對(duì)ELISA的反應(yīng)條件進(jìn)行了探索，確定了抗原的最適包被濃度為5μg/mL，檢測(cè)血清稀釋液為100倍稀釋，血清與抗原反應(yīng)最佳反應(yīng)時(shí)間為1小時(shí)，酶標(biāo)二抗最佳作用時(shí)間為1小時(shí)，底物的最佳顯色時(shí)間為15分鐘。批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)，變異系數(shù)小于10％；批間重復(fù)試驗(yàn)，變異系數(shù)小于15％，說明具有很好的重復(fù)性。用此方法檢測(cè)包被的抗原不與NDV,AI，IBDV等陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，表明建立的ELISA診斷方法，