基于香豆素類熒光團(tuán)的反應(yīng)型熒光探針的設(shè)計(jì)、合成及性能研究.pdf

1、半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hey)、還原型谷胱甘肽(GSH)是人體細(xì)胞內(nèi)非常重要的三種小分子生物硫醇(Biothiols)，在生命體的各項(xiàng)生理活動中起著重要作用。Cys是多種蛋白的重要組成部分，參與基因翻譯后修飾、生物催化等重要生理過程;當(dāng)其在細(xì)胞中含量異常時，會引起人體生長緩慢、神經(jīng)性中毒、肝損傷等疾病。Hcy雖然在血清和細(xì)胞中是三種生物硫醇里含量最少的，但其作用不容忽視，是多種遺傳病的重要標(biāo)志，例如高胱氨酸尿癥、心血管畸形等

2、。GSH參與基因調(diào)節(jié)，與其氧化態(tài)維持著細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡;當(dāng)其含量異常便會導(dǎo)致各種惡性腫瘤、器官衰竭。有機(jī)小分子熒光探針是檢測生物樣本中生物硫醇的重要方法，簡單、靈敏，且不損傷生物樣本，有助于疾病的臨床診斷和生理過程研究。由于三種生物硫醇的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相似，目前需要克服的難點(diǎn)依然是如何有效識別一種生物硫醇，或者同時區(qū)分三種生物硫醇。
　　二氧化硫(SO2)衍生物被廣泛用作食品防腐劑、抗氧化劑，工業(yè)漂白劑、還原劑等，被人體吸入會引發(fā)

3、肺水腫，攝入過量則導(dǎo)致腹瀉、蕁麻疹等疾病。小分子肼(N2H4)同樣是工業(yè)生產(chǎn)和人類生活中必不可少的化學(xué)藥品，被人體過量攝入后會導(dǎo)致神經(jīng)中樞損傷等，已被認(rèn)為是可疑致癌物。利用傳統(tǒng)方法檢測SO2衍生物和肼，成本高且損傷生物樣本，利用有機(jī)小分子熒光探針檢測的方法被相繼報(bào)道，但是在實(shí)際樣品和生物樣本中的應(yīng)用相對較少。
　　熒光光譜法與其他方法相比較，具有選擇性好、靈敏度高、待測樣品制備方便、儀器操作簡單、實(shí)時響應(yīng)、空間分辨率高、生物成像等

4、優(yōu)勢。隨著熒光成像技術(shù)的發(fā)展，近幾年小分子熒光探針已成為監(jiān)控活細(xì)胞中生理過程的重要手段。香豆素類衍生物具有熒光量子產(chǎn)率高、Stokes位移大等優(yōu)點(diǎn)，通過對母環(huán)的修飾可以得到各種發(fā)射波段的熒光，被廣泛用作小分子探針的熒光團(tuán)。
　　本論文基于香豆素類熒光團(tuán)，結(jié)合被檢測物性質(zhì)，設(shè)計(jì)合成了八種反應(yīng)型小分子熒光探針，與被檢測物發(fā)生不可逆的化學(xué)反應(yīng)，通過反應(yīng)前后熒光信號的變化，達(dá)到定量檢測的效果。具體包括以下內(nèi)容:
　　第一章，簡要綜述

5、熒光探針的識別機(jī)理，以及香豆素類熒光團(tuán)的反應(yīng)型熒光探針的研究進(jìn)展。
　　第二章，合成了六種基于香豆素的小分子生物硫醇熒光探針ACCA、ACA、DPCA、PPN、DPCS、PBQC，不僅都可以在水溶液中裸眼識別不同的生物硫醇，同樣成功應(yīng)用于小牛血清和活細(xì)胞成像。
　　探針ACCA利用兩個相鄰的反應(yīng)位點(diǎn)，首先與一分子Cys/Hcy的巰基發(fā)生親核取代反應(yīng)，鄰位或間位氨基迅速發(fā)生分子內(nèi)重排，得到氨基取代產(chǎn)物，同時與另一分子Cys/H

6、cy發(fā)生縮合-環(huán)化作用，得到最終產(chǎn)物;與GSH的巰基發(fā)生親核取代反應(yīng)，繼而進(jìn)行分子內(nèi)縮合得到十二元環(huán)的亞胺正離子化合物，做到細(xì)胞內(nèi)、外均能比率區(qū)分GSH、Cys/Hcy，且互不干擾。探針ACA、DPCA利用丙烯酸酯為識別基團(tuán)，與Cys發(fā)生Michael加成-環(huán)化反應(yīng)，釋放出前體熒光團(tuán)，分別得到單一識別Cys的熒光增強(qiáng)信號和熒光比率增強(qiáng)信號。探針PPN同樣以丙烯酸酯為識別基團(tuán)，與GSH發(fā)生Michael加成反應(yīng)，得到熒光增強(qiáng)信號，在雙光子

7、激發(fā)條件下也可以定量檢測GSH。探針DPCS連接硝基磺酸酯為識別基團(tuán)，與小分子生物硫醇發(fā)生裂解反應(yīng)，得到兩個發(fā)射峰同時增強(qiáng)的比率型熒光信號，并且在雙光子激發(fā)條件下也可以定量檢測生物硫醇。探針PBQC以醌為識別基團(tuán)，與GSH發(fā)生Michael加成反應(yīng)，阻斷探針分子的PET過程和分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)作用，得到熒光增強(qiáng)信號。
　　第三章，合成具有紅色熒光的探針BICO，其結(jié)構(gòu)中的α，β-不飽和酮作為識別基團(tuán)，與SO2衍生物發(fā)生Michael加成反

8、應(yīng)，不僅用于活細(xì)胞比率熒光成像，還可以在自來水、白糖、白葡萄酒中定量檢測SO2衍生物，制作成試紙條也能夠裸眼識別亞硫酸氫鈉溶液的濃度。同時作為第一個亞硫酸氫根雙光子熒光探針，具有優(yōu)秀的雙光子熒光成像潛力。
　　第四章，合成含有兩個苯并吡喃結(jié)構(gòu)的近紅外熒光探針BPCC，利用螺環(huán)機(jī)理響應(yīng)小分子肼。探針不僅可以在PBS緩沖溶液中特異性響應(yīng)液態(tài)肼，也可以應(yīng)用于小牛血清和HeLa細(xì)胞中肼的檢測，進(jìn)一步將探針附著在硅膠板上可直接檢測氣態(tài)肼，裸

9、眼即可觀察到顏色變化。
　　本論文主要創(chuàng)新點(diǎn):
　　1.合成了八種香豆素類水溶性熒光探針，全部通過與被檢測物發(fā)生不可逆的化學(xué)反應(yīng)改變探針熒光性質(zhì)，裸眼即可觀察到識別效果，并且成功應(yīng)用于小牛血清或活細(xì)胞成像;
　　2.根據(jù)三種小分子生物硫醇結(jié)構(gòu)的細(xì)微差異，通過不同的識別機(jī)理，改變探針熒光團(tuán)性質(zhì)，得到區(qū)別檢測的效果。包括多種反應(yīng)類型:探針與一分子GSH的取代-環(huán)化作用，與兩分子Cys/Hcy的取代-重排-縮合-環(huán)化作用;α

10、，β-不飽和羰基作為識別基團(tuán)，與GSH的巰基發(fā)生Michael加成反應(yīng)，與Cys的巰基和鄰位氨基發(fā)生Michael加成-環(huán)化反應(yīng)。
　　3.以香豆素為熒光母體，連接吡唑啉、苯并咪唑、苯并吡喃等雜環(huán)得到了橘紅色熒光化合物H-DPC、紅色熒光探針BICO、近紅外熒光探針BPCC。化合物H-DPC具有兩個發(fā)射波長，可以結(jié)合各種熒光淬滅基團(tuán)和識別基團(tuán)得到比率型熒光探針;基于BICO、BPCC響應(yīng)前后明顯的顏色變化，可以進(jìn)一步做成試紙直接用