延遲低氧條件下E3泛素連接酶p53RFP介導(dǎo)HIF-1α降解機(jī)制的研究.pdf

1、缺血性疾?。ü跔顒?dòng)脈粥樣硬化性心臟病、缺血性腦血管疾病、外周血管缺血性疾?。┮呀?jīng)成為嚴(yán)重影響人類健康的重大疾病。因此，對于缺血性疾病，探索新的治療方法和途徑就顯得有一定的必要性。近年來，治療性血管新生(therapeutic angiogenesis)為治療缺血性疾病的治療提供了一個(gè)新的方向。在治療性血管新生中，選擇作用于血管新生不同階段的幾種因子聯(lián)合應(yīng)用或先后序貫性治療，或者選擇觸發(fā)血管新生的“主開關(guān)”的因子，可能取得更為明顯的療效。

2、缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)為上游細(xì)胞對低氧或缺氧，作出適應(yīng)性反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，已證實(shí)能誘導(dǎo)多達(dá)100多種轉(zhuǎn)錄因子，立體地調(diào)整血管生成，為血運(yùn)重建治療開辟新的思路。因此，HIF-1α是個(gè)十分有應(yīng)用前景的治療因子，在醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，得到了更多的重視。
　　目前已經(jīng)明確了HIF-1的結(jié)構(gòu)和調(diào)控位點(diǎn)，它是由HIF-1α和HIF-1β兩個(gè)亞單位組成異二聚體。其中，HIF

3、-1α是HIF-1能否發(fā)揮生物學(xué)活性的關(guān)鍵調(diào)節(jié)單位，其蛋白穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性受氧濃度的高度調(diào)節(jié);HIF-1β為組成性成分。在低氧條件下，HIF-1α表達(dá)水平增加，與HIF-1β形成異二聚體，從而具有生物學(xué)功能。HIF-1α穩(wěn)定性和活性受氧濃度的調(diào)節(jié)，是由于HIF-1旺含有氧依賴降解區(qū)(Oxygen Dependent Degradation Domain，ODDD)和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(TransactivationDomains)。常氧情況下，

4、ODDD區(qū)Pro402和/或Pro564被脯氨酸羥化酶(prolyl hydroxylase，PH)羥化后，被VHL腫瘤抑制蛋白(von Hippel-Lindau tumorsuppressor)復(fù)合物識(shí)別，通過泛素蛋白酶途徑降解。同時(shí)，HIF-1抑制因子(factorinhibiting HIF-1α，F(xiàn)IH)與HIF-1αC末端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(C-TAD)結(jié)合，通過803位點(diǎn)天冬酰胺殘基(Asn803)的羥化，阻止C-TAD與輔助激活

5、因子(CBP/p300)結(jié)合，從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性。在前期的研究中，本課題組已將HIF-1α的564、402、803三個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合定點(diǎn)突變，成功構(gòu)建了三突變型HIF-1α-Triple表達(dá)載體(pcDNA-(3.1+)-HIF-1α-Triple），使其在常氧下能夠穩(wěn)定高效表達(dá)，為單因素研究HIF-1α基因的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　p53RFP是新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡的一個(gè)重要基因，受p53基因的調(diào)控，其產(chǎn)物具有E3泛素連接酶

6、活性，通過泛素化降解凋亡重要啟動(dòng)信號(hào)p21WAF1參與細(xì)胞增殖和凋亡，從而參與細(xì)胞周期的調(diào)控。目前對這個(gè)基因的研究較少。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達(dá)增加時(shí)，p53RFP基因表達(dá)上調(diào)。而作為具有E3泛素連接酶活性的p53RFP，是否能夠和HIF-1α特異性識(shí)別，啟動(dòng)HIF-1α的泛素化降解途徑，以及可能存在的機(jī)制，并未有相關(guān)報(bào)道。
　　目的：
　　本研究擬通過驗(yàn)證p53RFP與HIF-1α的降解是否存在關(guān)系;進(jìn)而探

7、索其中可能存在的機(jī)制和通路，為進(jìn)一步研究可能對此過程進(jìn)行干預(yù)，使得HIF-1α在機(jī)體缺血低氧的環(huán)境中，發(fā)揮良性作用奠定理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1、SW480細(xì)胞置于低氧培養(yǎng)箱(1％ O2，94％ N2，5％ CO2)，在低氧培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)，檢測HIF-1α和p53RFP蛋白表達(dá)水平，明確兩種蛋白在延遲低氧的條件下，是否都存在降解過程，推斷兩者可能存在的關(guān)系。
　　2、加入蛋白酶抑制劑MG132，明確HIF-1α在

8、延遲低氧環(huán)境下，是否通過泛素蛋白酶體途徑進(jìn)行降解。
　　3、通過干擾試驗(yàn)，阻斷和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)p53RFP的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)HIF-1α在延遲低氧條件下的降解，是否和p53RFP相關(guān)。
　　4、通過RT-PCR的方法，證實(shí)p53RFP對HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平是否存在影響。
　　5、通過在常氧條件下，應(yīng)用三突變型HIF-1α真核表達(dá)載體，證明p53RFP對HIF-1α的降解調(diào)節(jié)功能，是否依賴于VHL。
　　6、通過在低氧

9、條件下，應(yīng)用p53抑制劑，探究p53RFP對HIF-1α的降解調(diào)節(jié)功能，是否依賴于p53。
　　7、通過免疫共沉淀方法，驗(yàn)證p53RFP是否通過泛素化方式和HIF-1α結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮其促進(jìn)HIF-1α降解的作用。
　　8、通過在低氧條件下，應(yīng)用組蛋白去乙?；敢种苿?，探究p53RFP對HIF-1α的降解調(diào)節(jié)功能，是否有組蛋白去乙?；窰DAC1和HDAC2的參與。
　　9、通過在低氧條件下，應(yīng)用HDAC1 SiRNA和

10、HDAC2 SiRNA，進(jìn)一步探究組蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC2參與p53RFP對HIF-1α的降解，是否與HIF-1α的乙酰化程度相關(guān)。
　　結(jié)果：
　　HIF-1α的蛋白水平在低氧誘導(dǎo)后開始增加，在觀察的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，6小時(shí)左右HIF-1α在細(xì)胞內(nèi)的達(dá)到最高峰，隨后的12，18，24小時(shí)內(nèi)HIF-1α發(fā)生降解，并最終維持在較低的表達(dá)水平。在檢測內(nèi)源性p53RFP蛋白表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著低氧培養(yǎng)時(shí)間的延長，p53RFP

11、的表達(dá)也有一定幅度的增加。
　　在加入蛋白酶抑制劑MG132后，HIF-1α的表達(dá)明顯上升，不同濃度的蛋白酶抑制劑MG132的阻斷HIF-1α降解效果，隨著濃度的增加，更加明顯。
　　與SW480細(xì)胞單獨(dú)低氧處理24小時(shí)組相比，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外源p53RFP質(zhì)粒（1，2和6μg）的細(xì)胞其胞內(nèi)HIF-1α蛋白的降解更為明顯，且p53RFP的表達(dá)量越高，促進(jìn)HIF-1α蛋白的降解作用越明顯。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外源p53RFPSiRNA(976)

12、1，2，6ug的細(xì)胞其胞內(nèi)HIF-1α蛋白的降解更不明顯，且p53RFP的表達(dá)量越低，減少HIF-1α蛋白的降解作用越明顯。
　　常氧和延遲低氧條件下，轉(zhuǎn)染p53RFP與否，HIF-1α mRNA含量未發(fā)生明顯變化。
　　p53RFP和pcDNA-3.1(+)-HIF-1α-triple轉(zhuǎn)染組與pcDNA-3.1(+)-HIF-1α-triple組相比，HIF-1α表達(dá)量明顯降低，降解增多，同時(shí)p53RFP的表達(dá)增加。p53

13、RFP轉(zhuǎn)染組與是否加入p53抑制劑相比，p53RFP和HIF-1α的表達(dá)量無明顯改變，和未加任何干擾因素相比，p53RFP明顯升高，HIF-1α明顯降低。
　　隨著低氧時(shí)間的延長，伴隨著其蛋白水平的降解，HIF-1α的乙酰化和泛素化修飾水平均逐漸增強(qiáng)。
　　瞬時(shí)轉(zhuǎn)染不同濃度的p53RFP質(zhì)粒1，2，6ug，經(jīng)低氧培養(yǎng)24小時(shí)后，結(jié)果提示在低氧狀態(tài)下p53RFP可以與HIF-1α直接結(jié)合，并促進(jìn)其泛素化修飾和降解。
　　

14、p53RFP轉(zhuǎn)染組與是否加入組蛋白去乙酰化酶抑制劑相比，HIF-1α的表達(dá)量明顯下降。
　　p53RFP轉(zhuǎn)染組與是否加入HDAC1 SiRNA和HDAC2 SiRNA組相比，HIF-1α的乙?；潭仍黾?，與p53RFP結(jié)合增加，HIF-1α的降解也增加。
　　結(jié)論：
　　1.在延遲低氧的條件下，HIF-1α的表達(dá)，在初期（6小時(shí)左右）呈逐漸上升，隨后隨著缺氧時(shí)間的延長，HIF-1α發(fā)生了降解，并維持在低水平。在相同條件

15、下，p53RFP的表達(dá)呈逐漸增加。
　　2.延遲低氧條件下，HIF-1α的降解是通過泛素-蛋白酶體通路。
　　第二部分:1.延遲低氧條件下，細(xì)胞轉(zhuǎn)染p53RFP質(zhì)粒后，p53RFP表達(dá)增加，促進(jìn)了HIF-1α降解，p53RFP的表達(dá)和HIF-1α的降解存在正相關(guān)性。
　　2.延遲低氧條件下，沉默p53RFP表達(dá)后，p53RFP表達(dá)減少，減少了HIF-1α降解，進(jìn)一步證實(shí)p53RFP的表達(dá)和HIF-1α的降解存在正相關(guān)性

16、。
　　3.常氧和延遲低氧條件下，p53RFP對HIF-1α的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有影響。
　　第三部分:1.p53RFP能夠促進(jìn)三突變HIF-1α的降解。
　　2.延遲低氧條件下，p53RFP參與的HIF-1α降解是VHL和p53非依賴的。
　　3.延遲低氧條件下，p53RFP可以與HIF-1α直接結(jié)合，并促進(jìn)其泛素化修飾和降解。
　　4.延遲低氧條件下，p53RFP參與的HIF-1α降解受到組蛋白去乙?；窰DA