番茄E3泛素連接酶SLBAH1基因的克隆及其功能研究.pdf

1、植物生長在自然環(huán)境中，面臨著各種微生物的挑戰(zhàn)。在這種長期相互作用、相互影響的共進化過程中，植物逐漸獲得了一系列復雜的防御機制來保護自己。這種先天免疫也是植物、昆蟲和脊椎動物共有的防御病原菌感染的機制。植物能通過特異識別病原菌的細胞壁、代謝物等成分，直接或間接識別相應的病原物，激活防御反應信號、產(chǎn)生超敏反應和一系列防御反應物質，最終產(chǎn)生抗病性。在植物的防御應答過程中，植物體自身會發(fā)生重要的代謝改變，以維持和調節(jié)細胞的正常生理過程。其中，泛

2、素介導的蛋白調控是一種廣泛存在的調控機制，對調控正常的細胞功能和植物對環(huán)境信號的反應起著重要作用。本研究從番茄中克隆一個泛素連接酶(ubiquitin ligase，E3)基因，并對基因的功能進行了研究。具體研究結果如下：
　?、鸥鶕?jù)BAH1基因序列，搜索番茄基因組數(shù)據(jù)庫，獲得一個EST。根據(jù)EST，設計引物，采用3'-RACE方法擴增獲得了全長的SLBAH1基因的cDNA序列。序列分析顯示，SLBAH1基因全長1002核苷酸，編

3、碼333氨基酸。功能預測顯示，編碼蛋白含有1個SPX結構域和1個RING(really interesting new gene，RING)結構域。
　?、聘鶕?jù)SLBAH1基因全序列，設計引物，分別構建了包含全基因序列、缺少RING結構域基因序列和RING結構基因序列的原核表達載體，表達了融合蛋白SLBAH1、SLBAH1dR和SLBAH1R。E3連接酶活性檢測顯示，SLBAH1和SLBAH1R具有體外泛素連接酶活性，而SLBAH

4、1dR無E3酶活性。
　?、菢嫿?5S-SlBAH1∷GFP融合蛋白，通過打基因槍的方法把質粒載體轉入已在MS0中鋪好洋蔥表皮，利用熒光顯微鏡進行觀察。亞細胞定位分析結果顯示，SLBAH1蛋白定位于細胞質和細胞核。
　?、壤肦T-PCR方法對番茄中SLBAH1基因的器官特異性和對生物和非生物脅迫的表達特性進行了研究分析。結果顯示，SLBAH1在根中的表達量高于葉和莖;并受灰霉病菌的誘導調控，在病原體感染的早期階段被激活，

5、之后表達量降低;防衛(wèi)信號分子ABA、SA和MeJA也能不同程度的誘導著SLBAH1基因的表達量。上述結果表明了，SLBAH1基因可能在自身防御病害方面發(fā)揮著作用。
　?、蓪Ψ延酌绲碾x體葉片進行灰霉菌離體接種當經(jīng)PDS沉默的植株出現(xiàn)葉片退綠時，提取經(jīng)pTRV SlBAH1處理的番茄幼苗葉片的總RNA，用Real Time PCR方法檢測SlBAH1基因的表達水平。結果表明，SlBAH1基因的表達量下調了30％～70％。生物形態(tài)觀察