姜黃素對(duì)H2O2誘導(dǎo)ARPE-19氧化應(yīng)激的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、老年性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)為年齡相關(guān)的一類黃斑疾病。
　　為探討姜黃素對(duì)RPE氧化應(yīng)激的保護(hù)機(jī)制，本研究觀察了姜黃素對(duì)H2O2誘導(dǎo)RPE氧化應(yīng)激的保護(hù)作用，miR199a在此保護(hù)機(jī)制中的作用，氧化應(yīng)激關(guān)鍵基因產(chǎn)物Nrf2及血紅素氧化酶1(heme oxygenase1，HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl cysteine synthetase，

2、γ-GCS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、醌氧化還原酶1(quinoneoxidoreductase1，NQO1)等抗氧化酶在姜黃素抗氧化機(jī)制中的作用，以及予以miR199a模擬及抗miR199a后上述相應(yīng)分子的變化，并討論p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)在此抗氧化應(yīng)激機(jī)制中的作用。從抗氧化層面對(duì)姜黃素如可保護(hù)R

3、PE進(jìn)行闡述，為AMD的防治提供新的想法和思路。本文主要從以下幾部分展開(kāi)論述:
　　第一部分 姜黃素可緩解H202所誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞的氧化應(yīng)激
　　目的:研究不同濃度H2O2對(duì)ARPE-19氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)，對(duì)細(xì)胞活力的影響，以探尋最適宜誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的最佳H2O2濃度。篩選適宜預(yù)處理干預(yù)的姜黃素濃度，并探討姜黃素對(duì)H2O2誘導(dǎo)ARPE-19氧化損傷的改善情況。
　　方法:取傳代5至7代的ARP

4、E-19細(xì)胞，10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、500μmol/L H2O2分別作用于ARPE-19細(xì)胞18h，采用CellTiter-Blue對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(super oxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)水平，篩選可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的最合適的H2O2濃度

5、。采用CellTiter-Blue對(duì)5rmol/L、10μmol/L、20μrmol/L、30μmol/L姜黃素作用6h后ARPE-19細(xì)胞的活力進(jìn)行檢測(cè)，篩選合適的姜黃素干預(yù)濃度，并進(jìn)一步研究其對(duì)H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。
　　結(jié)果:100μmol/L H2O2培養(yǎng)16h足以引起ARPE-19細(xì)胞內(nèi)氧化水平顯著升高、抗氧化水平顯著下降，對(duì)ARPE-19細(xì)胞產(chǎn)生足夠的氧化應(yīng)激引起細(xì)胞活力的下降。而10μmol/

6、L姜黃素預(yù)處理6h可緩解外源100μmol/LH2O2處理18h所誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞內(nèi)MDA的升高及SOD、GSH-Px活力的下降，以及細(xì)胞活力的下降。
　　結(jié)論:H2O2可誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激，引起MDA增加、SOD及GSH-Px活力下降，細(xì)胞活力下降，成功構(gòu)建氧化應(yīng)激模型;而姜黃素則可緩解外源H2O2誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。
　　第二部分 miR199a/Nrf2通路在姜黃素緩解H202所誘

7、導(dǎo)ARPE-19氧化應(yīng)激中的作用
　　目的:探討miR199a/Nrf2及其下游的HO-1、γ-GCS、NQO1在姜黃素緩解H2O2所誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中的作用及其機(jī)制。
　　方法:對(duì)0μmol/L姜黃素6h+0μmol/LH2O2處理18h、10μmol/L姜黃素6h+0μmol/L H2O2處理18h、0μmol/L姜黃素6h+100μmol/L H2O2處理18h、10μmol/L姜黃素培養(yǎng)6h+10

8、0μmol/L H2O2處理18h，四種條件下ARPE-19細(xì)胞miR199a表達(dá)水平，Nrf2 mRNA、蛋白表達(dá)水平及其靶基因HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA、蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:姜黃素可抑制H2O2引起的ARPE-19細(xì)胞miR199a水平的上升及Nrf2蛋白質(zhì)、mRNA表達(dá)水平的下降，逆轉(zhuǎn)H2O2引起的ARPE-19細(xì)胞HO-1、γ-GCS、NQO1在mRNA、蛋白表達(dá)水平的下降。
　　結(jié)論:姜黃

9、素可抑制H2O2引起的ARPE-19細(xì)胞miR199a表達(dá)，繼而上調(diào)Nrf2 mRNA、蛋白質(zhì)水平表達(dá)，上調(diào)Nrf2靶基因HO-1、γ-GCS、NQO1 mRNA、蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，藉此實(shí)現(xiàn)其抗氧化作用。
　　第三部分 miR199a對(duì)ARPE-19細(xì)胞Nrf2及其靶基因表達(dá)的影響
　　目的:通過(guò)構(gòu)建、轉(zhuǎn)染miR199a-mimic序列來(lái)模擬miR199a的作用，觀察、探討miR199a對(duì)Nrf2及其靶基因表達(dá)的作用;通過(guò)構(gòu)

10、建、轉(zhuǎn)染anti-miR199a序列來(lái)探討、研究將miR199a表達(dá)下調(diào)后Nrf2及其靶基因表達(dá)的變化，藉此揭示miR199a對(duì)Nrf2、Nrf2靶基因表達(dá)的影響及miR199a、Nrf2在姜黃素抗氧化機(jī)制中的作用。
　　方法:通過(guò)構(gòu)建、轉(zhuǎn)染miR199a-mimic序列和anti-miR199a序列來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)miR199a上調(diào)或抑制，并對(duì)miR199a上調(diào)或抑制后Nrf2及其靶基因mRNA、蛋白表達(dá)水平的變化進(jìn)行觀察。
　　

11、結(jié)果:miR199a-mimic轉(zhuǎn)染可顯著抑制ARPE-19細(xì)胞Nrf2及其靶基因HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA、蛋白表達(dá)水平;anti-miR199a轉(zhuǎn)染可顯著增加ARPE-19細(xì)胞Nrf2及其靶基因HO-1、γ-GCS、NQO1的mRNA、蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)論:轉(zhuǎn)染miR199a-mimic序列可模擬miR199a高表達(dá)的作用，增加miR199a可以導(dǎo)致Nrf2及其靶基因在mRNA、蛋白質(zhì)水平表達(dá)的下調(diào);轉(zhuǎn)染an

12、ti-miR199a序列可以成功模擬姜黃素對(duì)Nrf2及其靶基因表達(dá)的改變，重現(xiàn)miR199a下調(diào)后Nrf2及其靶基因表達(dá)的變化，即姜黃素可以通過(guò)抑制miR199a表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)Nrf2及其靶基因表達(dá)的上調(diào)。
　　第四部分 姜黃素對(duì)Nrf2核轉(zhuǎn)位的影響及p38 MAPK在姜黃素Nrf2抗氧化中的作用
　　目的:探討姜黃素對(duì)Nrf2分布、核轉(zhuǎn)位的影響，通過(guò)聯(lián)合p38MAPK特異的抑制劑SB203580，進(jìn)一步觀察、研究p38MAP

13、K對(duì)Nrf2蛋白表達(dá)的影響，探討p38MAPK在姜黃素Nrf2抗氧化中的作用。
　　方法:測(cè)定0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L姜黃素培養(yǎng)6h后ARPE-19細(xì)胞核內(nèi)Nrf2水平及核內(nèi)Nrf2(nuclear Nrf2，nuc-Nrf2)與總Nrf2(total Nrf2，T-Nrf2)比值的變化。測(cè)定0μmol/L、20μmol/L SB203580預(yù)處理2h，而后0μmol/L、10μmol/

14、L姜黃素再培養(yǎng)6h后Nrf2水平及Nrf2靶基因HO-1、γ-GCS、NQ01的mRNA、蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:姜黃素不僅可以增加ARPE-19細(xì)胞Nrf2的表達(dá)，還可增加Nrf2的核轉(zhuǎn)位，增加細(xì)胞核內(nèi)Nrf2水平。p38MAPK特異抑制劑SB203580預(yù)處理可抑制p38MAPK磷酸化水平，可抑制姜黃素引起的Nrf2及其靶基因蛋白的表達(dá)，也即p38MAPK可能參與了Nrf2介導(dǎo)的姜黃素對(duì)ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激緩解過(guò)