視黃醇結(jié)合蛋白的純化、抗血清的制備和檢測方法的建立.pdf

1、視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)對肝臟、腎臟等疾病的診斷治療及預(yù)后監(jiān)測具有重要意義。臨床上RBP多采用適用于全自動生化分析儀的試劑盒進行檢測，但目前RBP檢測試劑盒大多為進口產(chǎn)品，價格昂貴，增加了檢測的成本，制約了臨床的推廣應(yīng)用。因此，國產(chǎn)試劑盒的研制具有重要的臨床價值。本文在已有的研究背景下，綜合考慮經(jīng)濟、操作等因素，開發(fā)出了一條新的RBP檢測試劑盒的研制路線，為RBP國產(chǎn)試劑盒的試生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
　　 本文以腎衰患者的新鮮尿液為原

2、料，利用硫酸銨鹽析法對尿液中的RBP蛋白進行分離提取，得到RBP蛋白的粗提物。通過單因素實驗及正交試驗對不同的蛋白溶液飽和度、鹽析溫度、鹽析時間等條件進行優(yōu)化，得到RBP蛋白的最佳鹽析工藝條件，此時RBP蛋白的提取濃度達到2.46mg/mL。通過驗證實驗，證實該條件下RBP的提取量最高。
　　 通過探索RBP蛋白粗提液的分離純化工藝路線，確定QSepharoseFastFlow柱層析和Superose12柱層析對RBP蛋白的純化

3、效果較好。利用單因素實驗和正交試驗研究不同實驗條件對純化效果的影響，得到兩步柱層析法的最佳工藝條件。純化后的蛋白溶液用全自動生化分析儀檢測RBP濃度，用Tricine-SDS-PAGE電泳檢測純度，確定得到的蛋白分子量為21kDa，是所要提取的RBP蛋白。此時RBP蛋白濃度為1.8mg/mL，純度為92％，計算得到產(chǎn)率為56％。
　　 進一步采用純化得到的RBP抗原免疫綿羊，頸動脈放血提取抗血清，并研究不同免疫時間對抗血清效價的