荔枝果皮多酚氧化酶內(nèi)源底物的確定及其促褐變機制.pdf

1、荔枝是一種具有高商業(yè)價值的亞熱帶水果，但其果皮在采后的快速褐變導致其商品價值降低。本研究從尋找荔枝表皮內(nèi)源底物的角度出發(fā)，在對荔枝表皮中主要的黃烷醇類化合物進行分離純化及結(jié)構鑒定和對荔枝表皮PPO分離純化的基礎上，通過研究荔枝表皮內(nèi)源底物與PPO的相互作用關系，及其在花色苷降解過程中的作用，進一步闡明荔枝表皮酶促褐變的機制。主要研究結(jié)果如下：
　　 1、經(jīng)HPLC-MS，NMR，CD等現(xiàn)代分析方法分析表明，荔枝中主要的黃烷醇類化

2、合物為(-)表兒茶素，原花青素B2，原花青素A2和原花青素A型三聚體表兒茶素-(4β→8，2β→O→7)-表兒茶素-(4β→8)-表兒茶素。且不同品種的荔枝表皮中主要的黃烷醇種類基本相同的，只是各化合物的含量略有差異。
　　 2、本研究建立了一種通過柱層析分離制備高純度荔枝表皮PPO的新方法，該方法有效地提高了荔枝表皮PPO分離純化的得率和純度。研究還表明本研究分離得到的荔枝表皮PPO為一種糖含量為50.0％的糖蛋白，SDS-聚

3、丙烯酰胺凝膠電泳測得其相對分子量為94.0kDa，其結(jié)構中可能含有多個糖基化位點。
　　 3、通過底物特異性和動力學分析，首次確定了荔枝表皮PPO的最適內(nèi)源底物為(-)-表兒茶素，且PPO對該底物有很強的親和力。反應體系的pH值對(-)-表兒茶素酶促氧化反應有很大影響。該酶促氧化是從PPO催化氧化（-）-表兒茶素生成相應的（-）-表兒茶素醌的反應開始，再由(-)-表兒茶素的C-8親核攻擊(-)-表兒茶素醌的B環(huán)，通過Michae

4、l-加成反應生成無色的脫氫二聚表兒茶素B。在pH值小于5.5的情況下，脫氫二聚表兒茶素B再被氧化生成黃色的脫氫二聚表兒茶素A，而在pH值大于7.0的情況下，脫氫二聚表兒茶素B則被氧化成脫氫二聚表兒茶素醌衍生物。另外，在pH5.5～7.0的情況下，脫氫二聚表兒茶素A和脫氫二聚表兒茶素醌衍生物同時生成，即脫氫二聚表兒茶素B被氧化為脫氫二聚表兒茶素A和脫氫二聚表兒茶素醌衍生物的反應同時發(fā)生。
　　 4、以（-）-表兒茶素為底物研究了荔

5、枝表皮PPO的酶學特性，研究表明，以（-）-表兒茶素為底物時荔枝表皮PPO活性的最適pH值為7.5，最適溫度為45℃。PPO在pH值小于4.5的環(huán)境中不穩(wěn)定，而在pH6.0-8.0的環(huán)境中穩(wěn)定。同時，研究還表明在45℃以上，PPO不穩(wěn)定，且PPO的變性溫度在70℃附近。
　　 5、本研究所用抑制劑除Vc外，均對PPO催化的（-）-表兒茶素和荔枝表皮黃烷醇提取物的氧化反應時具有顯著的抑制效果，且同種抑制劑在抑制這兩個反應時的抑制效

6、果相近，這說明同一種抑制劑對這兩個反應的抑制機制相似。因此，我們推測只要能有效抑制(-)-表兒茶素的酶促氧化就能有效抑制荔枝表皮黃烷醇類化合物的酶促氧化。(-)-表兒茶素的酶促氧化可能是引起黃烷醇類化合物氧化的起因。
　　 6、L-谷胱甘肽和L-半胱氨酸對PPO活性的抑制可能是兩種抑制途徑共同作用的結(jié)果：1．它們直接與PPO作用而抑制其活性；2．它們可以與醌形成無色的結(jié)合產(chǎn)物從而抑制酶活。Vc對PPO活性的抑制可能僅僅取決于它的

7、還原能力。NaF對PPO活性的抑制作用可能是由于其本身可以直接與PPO作用而抑制其活性。雖然L-谷胱甘肽和L-半胱氨酸都對（-）-表兒茶素的酶促氧化有很好的抑制效果，但是，這種效果是暫時的，從長期效果來看，它們都不能很好的抑制(-)-表兒茶素酶促氧化。隨著這些抑制劑在與酶促氧化生成的(-)-表兒茶素醌的反應中被消耗，有顏色的化合物就開始形成。同時，研究還表明，L-谷胱甘肽與（-）-表兒茶素醌反應生成無色的加成產(chǎn)物，而L-半胱氨酸與(-)

8、-表兒茶素醌反應生成有顏色的加成產(chǎn)物。
　　 7、矢車菊素-3-蕓香糖苷在僅有荔枝表皮PPO存在的情況下不會發(fā)生明顯的降解，但在有(-)-表兒茶素和荔枝表皮PPO同時存在的情況下快速降解。根據(jù)本研究結(jié)果，我們認為，荔枝表皮中的花色苷的降解機制如下：荔枝表皮PPO先氧化（-）-表兒茶素形成（-）-表兒茶素醌，該物質(zhì)再通過耦合氧化機制進一步導致花色苷的降解。研究結(jié)果還表明，花色苷和（-）-表兒茶素會競爭與(-)-表兒茶素醌反應，且這

9、種競爭與(-)-表兒茶素和花色苷的濃度有關。
　　 8、對荔枝采后貯藏過程中酚類化合物的變化的研究表明，荔枝表皮褐變在荔枝表皮膜功能散失后才發(fā)生，此時，荔枝表皮中主要的黃烷醇類化合物以及花色苷含量都明顯降低。而在膜功能散失前，荔枝表皮中主要的黃烷醇類化合物以及花色苷含量保持不變，且荔枝表皮未發(fā)生褐變。這說明荔枝表皮膜功能散失之后，（-）-表兒茶素與PPO結(jié)合，反應產(chǎn)生(-)-表兒茶素醌，該物質(zhì)再與荔枝表皮中的黃烷醇類化合物，花色