紫色達利菊提取縮合單寧對大腸桿菌和瘤胃氮代謝以及瘤胃微生物的影響.pdf

1、紫色達利菊(Petalostemun purpureum)是一種適應(yīng)性極強,適口性較好,并廣泛分布于北美草原上的一種豆科植物。紫色達利菊含有較高的縮合單寧并具有極強的抗致病性大腸桿菌的能力。但關(guān)于其縮合單寧對大腸桿菌的抑菌活性及可能機制,是否具有保護植物蛋白過瘤胃的作用以及對瘤胃微生物的影響并不清楚。因此,設(shè)計三個實驗來研究紫色達利菊縮合單寧對反芻動物的影響:
　　 實驗一、紫色達利菊所含縮合單寧對肉牛后腸大腸桿菌抑制能力及其作

2、用機理。
　　 在致病性大腸桿菌O157:H7的體外培養(yǎng)基中加入十一種不同植物縮合單寧(添加量:400μg/ml),結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅紫色達利菊所含縮合單寧表現(xiàn)出較強的抗致病性大腸桿菌O157:H7生物活性。同時,在厭氧條件下添加200μg/ml該縮合單寧表現(xiàn)出對大腸桿菌(ATCC25922)的抑制作用。穿透電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細胞膜在縮合單寧的作用下增厚,掃描電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)當(dāng)添加較高濃度縮合單寧時,大腸桿菌菌體表面被一層膜外

3、物質(zhì)包裹。大腸桿菌細胞膜的通透性在200μg/ml縮合單寧添加量下顯著降低。為進一步確定紫色達利菊所含縮合單寧對反芻動物后腸消化及后腸大腸桿菌的影響,分別在2009和2010年進行放牧試驗,試驗采用隨機區(qū)組設(shè)計,處理為對照組(不含紫色達利菊以雀麥草為主的草地),試驗組Ⅰ(以紫色達利菊與雀麥草為主的草地)和試驗組Ⅱ(以紫色達利菊與針茅草和雀麥草混合的草地)。于2009和2010年夏季和秋季在試驗地采集植物樣品和糞樣,用于分析植物和糞樣的化

4、學(xué)成分及糞樣中的大腸桿菌數(shù)量?？s合單寧含量在試驗組Ⅰ和Ⅱ顯著高于對照組(P＜0.01)。試驗組Ⅰ和Ⅱ動物糞樣中大腸桿菌的數(shù)量在2009年秋季和2010年夏秋季放牧中顯著低于對照組(P＜0.05)。秋季放牧中,對照組糞樣pH、總氮、有機物消化率、氨態(tài)氮和揮發(fā)性脂肪酸顯著高于試驗組Ⅰ和Ⅱ而乙酸/丙酸低于對照組(P＜0.05)。夏季放牧動物糞樣各指標(biāo)差異不顯著。因此,紫色達利菊所含縮合單寧可能通過改變大腸桿菌細胞膜或與細胞膜相互作用來抑制大腸

5、桿菌的生長,從而減少肉牛糞便中的大腸桿菌數(shù)量。
　　 實驗二、紫色達利菊及其與禾本科和豆科牧草混合氮代謝規(guī)律的研究。
　　 為確定紫色達利菊中縮合單寧的分布和體外瘤胃降解率,分別在營養(yǎng)生長期和盛花期采集整株植物,測定葉、莖和花所占的比例以及總酚,可提取單寧、蛋白結(jié)合單寧和纖維結(jié)合單寧的含量?；ㄖ锌偪s合單寧的含量顯著高于莖和葉的含量(P＜0.05)。營養(yǎng)生長期葉中的總酚和總縮合單寧都高于盛花期。紫色達利菊不同部位可提取單寧

6、的量遠高于蛋白結(jié)合單寧和纖維結(jié)合單寧。盛花期整株植物縮合單寧含量高于營養(yǎng)生長期(P＜0.001)。體外試驗采用2×2析因試驗設(shè)計,將不同草地采集的兩期植物放入三套DAISYII發(fā)酵器中,同時每個發(fā)酵器中的兩個發(fā)酵罐添加聚乙二醇(單寧活性抑制劑),分別在0,1,2,4,8,12,24,48和72h取樣。營養(yǎng)生長期具有較高的真干物質(zhì)和真氮消化率,同時干物質(zhì)和氮素中潛在降解部分(6)均高于盛花期。營養(yǎng)生長期干物質(zhì)中快速降解部分(α)要高于盛花

7、期(P＜0.001),而氮素中的快速降解部分卻低于盛花期(P＜0.01)。添加聚乙二醇后,營養(yǎng)生長期干物質(zhì)的慢速降解部分速率常數(shù)(C)增加(P＜0.01)但對盛花期無影響。添加聚乙二醇增加盛花期真氮素潛在降解部分,對營養(yǎng)生長期無影響。兩期紫色達利菊體外12h殘留飼料δ15N的含量在添加聚乙二醇后顯著增加(P＜0.01)。這表明紫色達利菊在營養(yǎng)生長期擁有較高的瘤胃消化率而在盛花期其縮合單寧對氮素的消化率有一定影響,同時兩期植物所含縮合單寧

8、均在消化過程中對微生物的附著有一定影響。但總的來看,高縮合單寧對紫色達利菊真干物質(zhì)和真氮的消化率影響不大。
　　 為確認紫色達利菊與冷季禾本科植物混合對瘤胃發(fā)酵和菌體蛋白合成的影響。測定了紫色達利菊與混合冷季植物樣品(冷季植物以雀麥草為主),并用縮合單寧含量在7,14,29和42g/kgDM的樣品進行體外發(fā)酵試驗。試驗采用4×2析因試驗設(shè)計,重復(fù)兩次。δ15N硫酸氨用來測定菌體蛋白合成效率。添加聚乙二醇并未對最大產(chǎn)氣量以及延遲期

9、產(chǎn)生影響,但能夠增加產(chǎn)氣率(P＜0.01)。隨著紫色達利菊含量的增加,12和48h體外真干物質(zhì)消化率均有所提高(P＜0.01)但菌體蛋白產(chǎn)量在12h有所下降(P＜0.01)。添加聚乙二醇增加12h真干物質(zhì)消化率(P＜0.01)。隨著縮合單寧含量的增加,添加聚乙二醇增加氨態(tài)氮和支鏈揮發(fā)性脂肪酸的含量并降低菌體蛋白的合成效率(P＜0.01)。這表明冷季植物中混合紫色達利菊能夠增加瘤胃降解率。含量為4.2％的縮合單寧對干物質(zhì)降解率無影響但能增

10、加菌體蛋白合成效率。
　　 為了確定紫色達利菊所含縮合單寧對保護豆科植物蛋白不被微生物降解成氨態(tài)氮的能力,同時確定對甲烷氣體產(chǎn)量以及瘤胃微生物的影響。試驗采用5×2析因試驗設(shè)計,用含δ15N標(biāo)記的苜蓿與紫色達利菊組成五個比例:100:0、75:0、50:50、25:75和0:100,同時添加或不添加聚乙二醇,重復(fù)三次。利用Ammoniaδ15Ndiffusion技術(shù)和Real-timePCR測定苜蓿蛋白向氨態(tài)氮中的轉(zhuǎn)化效率和微生

11、物的菌體拷貝數(shù)。隨著紫色達利菊比例的增加,添加聚乙二醇能夠顯著提高氨態(tài)氮和氨態(tài)氮中δ15N含量以及苜蓿δ15N向氨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化效率(P＜0.01)。添加聚乙二醇對48h內(nèi)消耗單位干物質(zhì)的甲烷氣體產(chǎn)量無影響。12h時,三種纖維降解菌,產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌,瘤胃白球菌和瘤胃黃球菌隨著紫色達利菊的比例增加而降低但差異不顯著。非纖維降解菌中甲烷菌,瘤胃鏈球菌和嗜淀粉瘤胃桿菌的拷貝數(shù)同樣隨著紫色達利菊的比例增加而降低但差異不顯著。這表明,縮合單寧能夠減

12、少瘤胃發(fā)酵氨態(tài)氮的濃度,同時減少混合苜蓿氮向氨態(tài)氮的轉(zhuǎn)化,從而保護苜蓿中的氮不以氨態(tài)氮的形式損失。
　　 實驗三、縮合單寧對主要瘤胃微生物的影響以及微生物對縮合單寧的適應(yīng)性
　　 微生物純培養(yǎng)試驗選用3種纖維降解菌并在含縮合單寧O和25μg/ml培養(yǎng)液中以纖維素為底物,在試驗開始前適應(yīng)21天,然后在含縮合單寧0、75、150、300和450μg/ml中進行濾紙消化試驗。同時選用四種非纖維降解菌在含縮合單寧0和50μg/m

13、l中培養(yǎng)并適應(yīng)15天,然后添加0、100、200、400和600μg/ml縮合單寧并測定生長曲線。當(dāng)縮合單寧含量為75μg/ml時,降低產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌,瘤胃白球菌和瘤胃黃球菌的濾紙消化率(P＜0.01)。掃描電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)縮合單寧含量高于150μg/ml時,纖維降解菌停止生長,纖維表面出現(xiàn)大量絮狀物質(zhì)。而非纖維降解菌中,瘤胃普雷沃氏菌,嗜淀粉瘤胃桿菌以及瘤胃鏈球菌對縮合單寧比較敏感,在含量為200μg/ml即顯著改變其生長曲線,而

14、反芻動物半月形單胞菌在縮合單寧含量為600μg/ml仍能較好的生長。試驗選用三種纖維降解菌和四種非纖維降解菌均未表現(xiàn)出對縮合單寧的適應(yīng)性。因此,高劑量縮合單寧對瘤胃微生物有抑制作用并影響纖維降解菌的附著。
　　 綜上所述,紫色達利菊是一種高縮合單寧、高蛋白的豆科植物,其縮合單寧能夠通過與細胞膜相互作用抑制大腸桿菌,并能夠降低反芻動物后腸大腸桿菌的數(shù)量。同時,紫色達利菊與其它冷季草地植物混合后能夠提高真干物質(zhì)消化率。紫色達利菊與苜