高產雷帕霉素吸水鏈霉菌的遺傳改造和發(fā)酵過程優(yōu)化.pdf

1、雷帕霉素（Rapamycin）又名西羅莫司（Sirolimus），是由吸水鏈霉菌(S.hygroscopicus)產生的新型三烯含氮大環(huán)內酯抗生素。雷帕霉素除作為免疫抑制劑外，目前還廣泛應用于器官移植、皮膚病、心臟病等領域。本文以實驗室保存的低產雷帕霉素產生菌為出發(fā)菌株，通過傳統(tǒng)誘變育種技術，結合高通量篩選手段，輔以培養(yǎng)基優(yōu)化，大幅度提高了雷帕霉素產生菌的生產能力，并在發(fā)酵罐進行了中試及放大。同時，采用原生質體育種及基因組重排等新技術對

2、雷帕霉素產生菌進行選育，并初步探索了雷帕霉素的異源合成。
　　 試驗首先初步優(yōu)化了雷帕霉素產生菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，確定了最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基為：4％葡萄糖，1%甘油，1%黃豆餅粉，0.15%L-Lys，0.5%K2HPO4，0.5%KH2PO4，0.5%氯化鈉，0.2%硫酸鎂，0.15%硫酸亞鐵。較優(yōu)的搖瓶發(fā)酵條件是：搖瓶裝液量為20ml/250ml，培養(yǎng)溫度為28℃，接種后培養(yǎng)5天收獲菌體。在以上最優(yōu)條件下，原始菌株發(fā)酵液中雷帕

3、霉素產量最高可達120mg/L.
　　 為提高雷帕霉素產量，開展了雷帕霉素產生菌的誘變育種研究。首先考察了紫外線、DES、NTG等不同誘變劑的劑量效應。然后通過單一誘變劑連續(xù)誘變、不同誘變劑交替誘變、不同誘變劑連續(xù)誘變等多種誘變方式，篩選到產量為279mg/L的誘變菌株D7-804，比出發(fā)菌株提高了156%。進一步發(fā)展了基于96孔板培養(yǎng)的雷帕霉素突變株的高通量篩選新技術，通過對約100，000個單菌落的快速高效篩選，篩選到高產突

4、變菌株N5632，其最高產量達到445mg/L。
　　 在以上高產菌選育和搖瓶發(fā)酵優(yōu)化的基礎上，開展了在120L發(fā)酵罐上的雷帕霉素發(fā)酵的放大研究。結果表明，初始攪拌轉速設定為200rpm，在進入產物合成期后轉速升至400rpm，控制整個發(fā)酵過程中溶氧不低于10%，雷帕霉素產量最高達到412mg/L，基本達到了搖瓶發(fā)酵的平均水平。在此基礎上，開展了采用多種補料方式提高發(fā)酵水平的研究。結果表明，40h為最佳補料時間，采用多組分組合補

5、料方式能夠最大幅度提高發(fā)酵水平，其中組合補料甘油與磷酸鹽的方式，不僅能夠保持發(fā)酵液的pH值的相對穩(wěn)定，而且能有效提高雷帕霉素產量，發(fā)酵水平最高可達800mg/L以上。最后，將這一新型補料發(fā)酵工藝在20噸發(fā)酵罐上進行工業(yè)放大，雷帕霉素發(fā)酵水平也達到了700mg/L，產量較本課題開始時的最初發(fā)酵水平提高了4倍以上。
　　 為了最大程度地提高雷帕霉素高產菌選育的效率，開展了基因組重排技術改造吸水鏈霉菌的遺傳性能，提高雷帕菌素發(fā)酵水平的

6、研究。首先確定了雷帕霉素產生菌原生質體制備、再生和融合的較優(yōu)條件；然后通過吸水鏈霉菌原生質體誘變、融合以及與紅霉素生產菌原生質體的種間融合等技術，得到具有不同遺傳特性的產雷帕菌素產量較高的突變株。最后，對7株雷帕霉素高產突變株進行一輪基因組重排育種，結果篩選到一株產量較高菌株(GS-1437)，雷帕霉素產量達到445mg/L，比最初出發(fā)菌株產量提高了59.5%，充分顯示了基因組重排技術在改造鏈霉菌遺傳特性方面的巨大潛力，與傳統(tǒng)誘變育種方

7、法比較，具有快速高效等顯著優(yōu)點。。
　　 開展了雷帕霉素生物合成基因鏃在異源宿主菌中表達及生物合成雷帕霉素的研究。在已構建的三種雷帕霉素異源合成系統(tǒng)中，白色鏈霉菌S. albus28-1-1發(fā)酵產物樣品表現出與雷帕霉素標準品類似的抗菌生物活性。通過初步的結構鑒定和分析，該發(fā)酵產物樣品中的未知生物活性物質是一種生物活性類似雷帕霉素但結構上有較大區(qū)別的新化合物。進一步從轉錄水平上對異源宿主菌中雷帕霉素生物合成基因鏃中的各個基因進行了