

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
1、普那霉素(pristinamycin)是由始旋鏈霉菌(Streptomycespristinaespiralis)產(chǎn)生的一種鏈陽性菌素類(Streptogramin)抗生素,包含普那霉素I(PI)和普那霉素II(PII)兩類化合物,對大多數(shù)革蘭氏陽性菌,如MRSA、MRSE等均具有較強的殺菌活性,且抗生素后效應(yīng)較長,被視為治療頑固性革蘭氏陽性菌感染的特選藥物.目前,普那霉素已經(jīng)在國外實現(xiàn)商品化生產(chǎn),我國還未進行工業(yè)生產(chǎn).因此,作為藥效優(yōu)
2、良的抗生素,對普那霉素進行深入的研究和開發(fā)具有重要意義。
本論文以提高普那霉素的發(fā)酵水平為目標,對始旋鏈霉菌的基因組重排、高產(chǎn)菌株培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化以及高產(chǎn)菌產(chǎn)物合成分子機理等進行了深入細致的研究,獲得了如下主要研究結(jié)果:
1.以S.pristinaespiralis0957作為原始菌株,利用紫外誘變獲得四株普那霉素產(chǎn)量和耐受性都有所提高的菌株作為基因組重排的出發(fā)菌株。對始旋鏈霉菌原生質(zhì)體制備和再生過程
3、進行了研究,確定了合適的制備方案為:添加0.6%的甘氨酸到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌絲,用2%的溶菌酶在32℃下酶解1.5 h。始旋鏈霉菌的原生質(zhì)體制備率和原生質(zhì)體再生率分別達到了95.8%和18.1%。
2.對四株出發(fā)菌株(M-23、M-79、M-113和M-156)連續(xù)以原生質(zhì)融合的方式進行基因組重排,然后以普那霉素自身耐受性的提高作為篩選依據(jù),獲得了一株高產(chǎn)突變菌株G4-17,它的原生質(zhì)體對普那霉素耐受性高達100μg/mL
4、,搖瓶培養(yǎng)時普那霉素產(chǎn)量達到0.89 g/L,比產(chǎn)量最高的親本菌株提高了89.4%,比原始出發(fā)菌株提高了145.9%。通過連續(xù)傳代實驗,確定高產(chǎn)菌株G4-17的遺傳穩(wěn)定性良好。
3.研究了S. pristinaespiralis G4-17菌株的搖瓶發(fā)酵條件,通過正交設(shè)計對發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化;考察了搖瓶培養(yǎng)條件對菌體生長和產(chǎn)物合成的影響。優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:可溶性淀粉3.0%、蔗糖1.0%、葡萄糖0.5%、麥芽糖0
5、.8%、黃豆餅粉1.2%、蛋白胨0.4%、魚粉1.2%、酵母粉0.6%、(NH4)2SO40.2%、MgSO40.35%、KH2PO40.02%、CaCO30.4%,NaNO30.075%;優(yōu)化的搖瓶培養(yǎng)條件為:初始pH值為6.5,在25mL/250 mL三角瓶中以6%接種量接入經(jīng)過36 h培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液,在25℃,220 rpm條件下進行培養(yǎng)60 h,S.pristinaespiralis G4-17的普那霉素產(chǎn)量達到了1.21 g
6、/L,比優(yōu)化前的產(chǎn)量(0.89 g/L)提高了40.0%。在5-L發(fā)酵罐上,優(yōu)化后的培養(yǎng)條件更有利于高產(chǎn)菌種G4-17合成,G4-17在培養(yǎng)60 h時普那霉素產(chǎn)量達到最大值1.237 g/L。
4.利用ApaI/TaqI雙酶切的AFLP技術(shù)對3支篩選出的普那霉素高產(chǎn)菌株以及它們的原始菌株CGMCC0957進行了遺傳多態(tài)性研究.結(jié)果顯示,高產(chǎn)菌株間具有類似的AFLP指紋圖譜,相比而言,高產(chǎn)菌株與原始菌株間的AFLP指紋圖譜差
7、異稍大。因此,在這些高產(chǎn)菌株特別是產(chǎn)量水平類似的菌株中存在類似的變異機理導致了普那霉素的產(chǎn)量提高。另外,AFLP分析還表明基因組重排技術(shù)較傳統(tǒng)誘變育種更容易使微生物菌株產(chǎn)生基因組水平的變異,因此,利用基因組重排技術(shù)進行微生物育種工作較傳統(tǒng)誘變育種技術(shù)更為有效。
5.利用RT-PCR技術(shù)檢測了普那霉素生物合成相關(guān)基因及其抗性基因在高產(chǎn)菌株G4-17和原始菌株CGMCC0957表達的豐度變化,分析了這些基因表達水平與合成普那霉
8、素的關(guān)系。結(jié)果顯示PI組分生物合成相關(guān)基因snbA在高產(chǎn)菌株的整個發(fā)酵進程中始終保持高豐度表達,而原始菌株只在發(fā)酵前期(24~48 h)高豐度表達,隨后逐漸降低。因此snbA基因的持續(xù)高表達與高產(chǎn)菌株的PI組分高產(chǎn)密切相關(guān)。PII組分生物合成基因snaB基因在在這兩個菌株的發(fā)酵過程中表達豐度變化與snbA基因的表達變化類似,表明snaB基因的持續(xù)高表達與高產(chǎn)菌株的PII組分高產(chǎn)密切相關(guān)。其它兩個PII組分生物合成基因snaA、snaC在
9、高產(chǎn)菌株和原始菌株的發(fā)酵過程中無明顯差異。研究還發(fā)現(xiàn),對普那霉素產(chǎn)生抗性的ptr基因在高產(chǎn)菌株的整個發(fā)酵進程中表達豐度較高,而在原始菌株中僅在發(fā)酵中后期(48~96 h)保持較高豐度表達。因此,ptr基因在高產(chǎn)菌株開始合成普那霉素之前就已經(jīng)高表達,從而建立起了自我保護性抗性,這種抗性的提前建立與普那霉素高產(chǎn)密切相關(guān)。另外,普那霉素生物合成的調(diào)控基因spbR在高產(chǎn)菌株和原始菌株發(fā)酵過程中的基因表達豐度沒有顯著變化,表明這個調(diào)控基因的表達與
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 普那霉素產(chǎn)生菌基因組重排育種.pdf
- 產(chǎn)普那霉素始旋鏈霉菌發(fā)酵的代謝調(diào)控、條件優(yōu)化及軟測量建模研究.pdf
- 始旋鏈霉菌普那霉素的固定化及原位分離發(fā)酵.pdf
- 始旋鏈霉菌普那霉素發(fā)酵及與分離耦合工藝研究.pdf
- 始旋鏈霉菌普那霉素生物合成相關(guān)基因的克隆、功能和表達研究.pdf
- 納他霉素產(chǎn)生菌基因組重排育種.pdf
- 利用基因組重排技術(shù)選育土霉素高產(chǎn)菌株.pdf
- 腈水合酶高產(chǎn)菌的基因組重排育種及其發(fā)酵過程控制的研究.pdf
- 納他霉素產(chǎn)生菌基因組重排選育高產(chǎn)菌株.pdf
- 48996.山東鏈霉菌誘變育種及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究
- 高產(chǎn)ε-聚賴氨酸白色鏈霉菌的誘變育種與發(fā)酵優(yōu)化.pdf
- 普那霉素高產(chǎn)相關(guān)基因的篩選與克隆.pdf
- 多拉菌素產(chǎn)生菌基因組重排育種.pdf
- 高產(chǎn)雷帕霉素吸水鏈霉菌的遺傳改造和發(fā)酵過程優(yōu)化.pdf
- 金色鏈霉菌發(fā)酵條件優(yōu)化及高產(chǎn)菌株選育的新方法.pdf
- 阿維菌素產(chǎn)生菌基因組重排育種研究.pdf
- 降膽固醇霉菌發(fā)酵條件的優(yōu)化及誘變育種.pdf
- 阿維鏈霉菌高產(chǎn)多拉霉素的發(fā)酵工藝研究.pdf
- 多殺菌素產(chǎn)生菌的基因組重排育種.pdf
- 普那霉素發(fā)酵工藝研究.pdf
評論
0/150
提交評論