CodY蛋白在嗜熱鏈球菌氮代謝調(diào)控中的作用研究.pdf

1、嗜熱鏈球菌作為酸奶發(fā)酵劑的一個(gè)關(guān)鍵組成部分，對(duì)酸奶質(zhì)地和風(fēng)味的形成具有重要作用。由于菌株的生長需要充足的碳源、氮源供應(yīng)，因此對(duì)菌株碳源氮源利用能力的調(diào)控成為改善菌株生長的一個(gè)重要手段，而對(duì)于嗜熱鏈球菌氮代謝的調(diào)控方面的研究報(bào)道較少，絕大多數(shù)數(shù)據(jù)是從乳酸乳球菌推斷而來的。CodY是存在于革蘭氏陽性細(xì)菌中的一種全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以對(duì)200多個(gè)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，這些基因一般在對(duì)數(shù)生長時(shí)期時(shí)受到阻遏，在營養(yǎng)物質(zhì)缺乏步入穩(wěn)定期之后又被誘導(dǎo)獲

2、得表達(dá)，進(jìn)而幫助細(xì)胞來適應(yīng)營養(yǎng)僵乏的時(shí)期。根據(jù)已公布的嗜熱鏈球菌基因組信息(NC_006449和NC_008532等)推斷，發(fā)酵酸奶最廣泛使用發(fā)酵劑中的嗜熱鏈球菌中也應(yīng)含有一個(gè)類似的調(diào)控蛋白CodY，因此本研究主要通過構(gòu)建過量表達(dá)CodY蛋白的嗜熱鏈球菌突變株來分析該蛋白在嗜熱鏈球菌中的作用機(jī)制，試圖尋找CodY蛋白對(duì)嗜熱鏈球菌的氮代謝的影響。
　　 本課題根據(jù)對(duì)嗜熱鏈球菌KLDS3.0503的內(nèi)源質(zhì)粒進(jìn)行分析，確認(rèn)其可以作為宿

3、主細(xì)胞，提取DNA并設(shè)計(jì)相應(yīng)引物擴(kuò)增出了codY基因。對(duì)pMEU5α載體的質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證后與codY片段進(jìn)行連接，成功構(gòu)建了CodY過表達(dá)重組質(zhì)粒，為了能夠更好的驗(yàn)證CodY的作用，與此同時(shí)義構(gòu)建了載體自連質(zhì)粒，二者均成功電轉(zhuǎn)化入無質(zhì)粒菌株KLDS3.0503。利用已有的表達(dá)載體pNZCodY，經(jīng)Nisin誘導(dǎo)在乳酸乳球菌中表達(dá)出CodY蛋白，并使用HisTrap FF柱純化得到了重組蛋白His-CodY并鑒定該蛋白。通過SDS-PA

4、GE蛋白電泳、OD值的變化趨勢來驗(yàn)證CodY對(duì)其蛋白表達(dá)及生長趨勢的影響。根據(jù)NCBI中公布的嗜熱鏈球菌的全基因組序列查找出與其氮代謝相關(guān)的十三個(gè)基因分別為prtM、amiD、ilvA、ilvCilvD1、gdhA、CodY、bcaT、argF、pepA、peps、pepN、pepC，通過RT-Real Time PCR對(duì)這十三個(gè)基因進(jìn)行比較，說明CodY蛋白能夠控制這些基因的表達(dá)。
　　 本課題得出如下結(jié)論:
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5、.通過16S rRNA基因序列的測定鑒定了嗜熱鏈球菌KLDS3.0503，并通過質(zhì)粒分析確認(rèn)其可以作為宿主細(xì)胞。
　　 2.成功從嗜熱鏈球菌KLDS3.0503中克隆出了codY基因片段。
　　 3.構(gòu)建的CodY過量表達(dá)載體及自連載體成功的在嗜熱鏈球菌KLDS3.0503中得到復(fù)制，并對(duì)二者生長趨勢進(jìn)行OD值監(jiān)測，得出CodY蛋白可以調(diào)控原始菌株的生長趨勢。
　　 4.通過SDS-PAGE蛋白電泳明顯判斷出Co