突觸蛋白Homerlb-c介導病理性疼痛的脊髓和皮層機制.pdf

1、疼痛是一種與組織損傷或潛在的損傷相關的，人類共有而個體差異很大的不愉快的主觀感覺和情感體驗。疼痛提供機體受到威脅的警報信號，同時也給患者帶來痛苦。疼痛按時程可以分為急性疼痛和慢性疼痛。各種原因引起的慢性疼痛是導致勞動力喪失的重要原因。在過去的幾十年中，從外周到中樞，對疼痛及其機制的研究取得了長足的進展，發(fā)現(xiàn)了一些新的藥物作用靶點，并且開發(fā)了多種用于治療的藥物。但是，仍有大量病人時刻遭受著疼痛的折磨。
　　 前扣帶皮層(antei

2、or cingulate cortex，ACC)是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分。ACC接受來自皮層下多種信息的傳入又可恒定地被外周傷害性刺激所激活，成為近年來疼痛研究的熱點區(qū)域。研究表明ACC不僅參與痛情緒的形成，還對疼痛感覺有調節(jié)作用。但是，外周傷害性刺激的持續(xù)傳入使ACC產生可塑性變化的分子機制，仍然知之甚少。
　　 研究認為，中樞突觸功能的重塑是疼痛慢性化的重要機制。谷氨酸及其受體系統(tǒng)是介導傷害性信息傳遞和突觸重塑最重要的遞質/

3、受體系統(tǒng)。突觸后致密物(postsynaptic density，PSD)是新近在谷氨酸能突觸后膜中發(fā)現(xiàn)的一種特殊結構。PSD中的多種蛋白質，能夠在突觸水平對谷氨酸受體進行募集整合。Homer1b/c是PSD家族的一員，最近研究發(fā)現(xiàn)Homer1b/c與慢性疼痛的發(fā)生有關，但未有進一步的研究報道。
　　 在慢性疼痛的研究中，完全弗氏佐劑(CFA)致大鼠慢性單關節(jié)炎模型(MA)和大鼠坐骨神經(jīng)慢性縮窄(chronic constric

4、tion injury，CCI)模型是兩種廣泛應用的慢性痛模型，良好地模擬了人類慢性疼痛所表現(xiàn)的自發(fā)痛和刺激誘發(fā)痛等現(xiàn)象。本研究應用動物行為學、免疫組織化學、免疫沉淀和共沉淀、以及 Western-Blot等方法，在大鼠關節(jié)炎和坐骨神經(jīng)慢性縮窄模型上探討了突觸蛋白Homer1b/c在介導慢性疼痛發(fā)生發(fā)展中的可能作用及其機制，為研究慢性疼痛的發(fā)病機理及尋找有效的藥物靶位，提供實驗依據(jù)。
　　 本實驗分為三個部分：
　　 1

5、.在大鼠關節(jié)炎和坐骨神經(jīng)慢性縮窄模型上，應用免疫組織化學、免疫沉淀和共沉淀等方法，檢測了脊髓背角以及前扣帶皮層(ACC)Homer1b/c的表達以及Homer1b/c與另一種突觸蛋白PSD-95的相互作用；
　　 2.應用動物疼痛指標測定的方法，觀察了鞘內注射Homer1b/c反義寡核苷酸對關節(jié)炎大鼠機械痛敏和熱痛敏的影響；
　　 3.應用免疫組織化學染色，在大鼠鞘內注射Homer1b/c反義寡核苷酸后，觀察Homer1

6、b/c在脊髓背角Fos表達和cAMP反應元件結合蛋白(CREB)磷酸化中的作用。
　　 結果發(fā)現(xiàn)：
　　 1.Homer1b/c在脊髓背角的表達特征
　　 與其他PSD蛋白的表達方式相似，Homer1b/c陽性細胞主要集中在脊髓背角淺層，在其他層次只看到很淺的免疫反應陽性信號。在高倍鏡下觀察，Homer1b/c免疫反應陽性物位于細胞膜，細胞呈圓形或橢圓形。免疫印跡結果發(fā)現(xiàn)，Homer1b/c在大鼠脊髓背角有較高表

7、達，而脊髓腹角未檢測到信號。
　　 2.CFA致炎后，大鼠脊髓背角Homer1b/c的表達增加
　　 在CFA致炎后，大鼠脊髓背角Homer1b/c的表達呈單側性增加，大鼠脊髓背角Homer1b/c和PSD-95的共沉淀增加。而PSD-95的表達未見增加。相反，在炎癥的基礎上，對大鼠踝關節(jié)施加強制曲伸的急性刺激(retrival)后，PSD-95的表達減少。
　　 3.在CFA致炎后，大鼠ACC Homer1b/

8、c和PSD-95表達以及相互作用發(fā)生變化
　　 大鼠在CFA致炎后，對側ACC Homer1b/c和PSD-95表達增加；對側 ACCHomer1b/c和PSD-95的共沉淀增加。該結果說明，在慢性疼痛狀態(tài)下，突觸后膜信號蛋白的相互作用加強。
　　 4.Homer1b/c參與神經(jīng)病理性疼痛的維持
　　 與先前研究結果一致，大鼠坐骨神經(jīng)慢性縮窄性損傷(CCI)后，損傷同側脊髓背角Homer1b/c表達增加；我們同時

9、發(fā)現(xiàn)，損傷對側ACC部位Homer1b/c和PSD-95的共沉淀增加。說明Homer1b/c同樣參與神經(jīng)病理性疼痛的維持。
　　 5.抑制Homer1b/c的表達對MA大鼠的痛敏反應有減輕作用
　　 鞘內應用Homer1b/c反義寡核苷酸(10μg/10μl)，每日1次，連續(xù)4天，抑制大鼠脊髓背角Homer1b/c的表達的同時，減輕了炎癥痛大鼠對機械刺激和熱刺激的痛敏反應。這種作用具有劑量依賴性。
　　 6.鞘內

10、給予Homer1b/c反義寡核苷酸(ODN)對大鼠急性疼痛和運動功能無影響
　　 鞘內給予錯義寡核苷酸(10μg/10μl)或反義寡核苷酸(10μg/10μl)，連續(xù)4天，測定機械和熱刺激反應閾值。結果發(fā)現(xiàn)，與給藥前比較，反義寡核苷酸對正常動物的機械縮足反射閾值(PWT)和熱縮足反射潛伏期(PWL)無顯著影響。對大鼠后肢的回縮，抓握功能以及整體動物的翻正反射評分顯示，鞘內給予Homer1b/c反義寡核苷酸(ODN)對大鼠運動功能

11、無影響。
　　 7.Homer1b/c介導初級中樞傷害性感受
　　 免疫組化結果顯示，鞘內應用Homer1b/c反義寡核苷酸，10μg/10μl，每日1次，連續(xù)4天，減輕了MA大鼠對傷害性刺激后，脊髓背角Fos蛋白的表達和CREB的磷酸化。該結果表明，Homer1b/c介導慢性疼痛時，初級中樞傷害性感受的信號轉導，以及下游的突觸功能的重塑。
　　 由以上結果得出如下結論：
　　 1.脊髓背角和前扣帶皮層H