特異性抗體定量檢測葡聚糖方法的研究.pdf

1、在甘蔗制糖工業(yè)中出現(xiàn)的葡聚糖主要為α-葡聚糖(又稱右旋糖酐，以下簡稱葡聚糖)，是腸膜明串珠菌屬產(chǎn)生的葡聚糖蔗糖酶將蔗糖轉(zhuǎn)化為α-D吡喃葡萄糖(主要是α-(1→6)結(jié)構(gòu)的葡萄糖)高分子聚合物多糖，其對制糖生產(chǎn)有較大影響，產(chǎn)生增大糖液的粘度，降低沉降速度、糖液的過濾性，使蔗糖結(jié)晶時生成異常形態(tài)的晶體等問題，因此，葡聚糖的實時監(jiān)測成為糖廠生產(chǎn)控制的一個重要技術(shù)。目前，葡聚糖檢測的主要方法是有著檢測過程操作繁瑣、檢測時間長、檢測結(jié)果準(zhǔn)確度較低以

2、及不適用于不同糖品等缺點化學(xué)分析方法。因此，建立一種方便快速、準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好、適用于各種樣品中葡聚糖的檢測方法勢在必行。本論文研究簡便、快速、準(zhǔn)確、價格合理的免疫學(xué)方法來測定葡聚糖的含量，使之適用于甘蔗制糖工業(yè)生產(chǎn)中的各種糖品中葡聚糖，對整個生產(chǎn)線中葡聚糖含量進行實時監(jiān)測，為提高生產(chǎn)管理效率提供依據(jù)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 (1)利用已制備好的抗葡聚糖單克隆抗體雜交瘤細胞，接種到Balb/C小鼠腹腔內(nèi)，產(chǎn)生含抗葡聚糖

3、單克隆抗體腹水；收集腹水，經(jīng)純化后得到純化抗體；摸索其凍干條件，進行穩(wěn)定性試驗，為葡聚糖免疫學(xué)檢測國產(chǎn)試劑盒中抗體的保存打下基礎(chǔ)。結(jié)果表明：通過純化，抗體純度可達到95％以上，葡聚糖特異性抗體的最佳凍干保護劑是濃度為10%的蔗糖，凍干后-20℃保存360天抗體效價變化不大。
　　 (2)研究比較《原糖》(GB15103-2006)國標(biāo)法和免疫比濁法測定葡聚糖的方法，探討了不同分子量葡聚糖、反應(yīng)時間對各自標(biāo)準(zhǔn)曲線測定的影響。結(jié)果表

4、明：兩種方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線均受葡聚糖分子量大小的影響，葡聚糖分子量大時影響較小，葡聚糖分子量小時，影響較大：最佳反應(yīng)時間分別是20min±10s，1min50s。確定測試條件后，研究這兩種方法檢測葡聚糖T-500線性范圍、檢測下限、分辨率、準(zhǔn)確度及重復(fù)性等參數(shù)。并對白砂糖、原糖、蔗汁樣品進行加標(biāo)回收及重復(fù)性試驗。結(jié)果表明：當(dāng)蔗糖濃度為16%時，原糖國標(biāo)法測定葡聚糖T-500標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.5206x-0.0035，線性范圍25-1000m

5、g/kg，檢測下限13.4mg/kg，分辨率是25mg/kg，檢測標(biāo)準(zhǔn)品糖液重復(fù)性RSD=0.84%，標(biāo)準(zhǔn)品糖液加標(biāo)平均回收率為95.5%，檢測部分樣品重復(fù)性平均RSD(%)=1.85％，樣品平均加標(biāo)回收率93.6%；免疫比濁法測定葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為T-500y=0.0937x+0.0266，線性范圍是51.9～3750.0mg/kg，檢測下限21.75mg/kg，分辨率為51.9mg/kg，檢測標(biāo)準(zhǔn)品糖液重復(fù)性RSD=0.38%，加標(biāo)平

6、均回收率為100%，檢測部分樣品重復(fù)性RSD(%)=0.52%，平均加標(biāo)回收率為99.9％，檢測結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品糖液高度一致?？偟膩碚f免疫比濁法要優(yōu)于《原糖》(GB15103-2006)國標(biāo)法。
　　 (3)研究抗體用量少的免疫比色法反應(yīng)時間和加樣量，探討樣品顏色對反應(yīng)結(jié)果的影響，并確定其線性范圍、檢測下限、精密度和重復(fù)性等參數(shù)，之后又對白砂糖、原糖、蔗汁樣品進行加標(biāo)回收及重復(fù)性試驗。結(jié)果表明：最佳反應(yīng)時間13min、100μL抗體

7、最佳加樣量1μL，檢測葡聚糖T-500線性范圍是312.5～5000.0mg/kg，檢測下限是221.3mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)性平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)=0.36，葡聚糖T-500標(biāo)準(zhǔn)品糖液平均加標(biāo)回收率(%)＝98.2%，略低于免疫比濁法，部分樣品重復(fù)性平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)＝0.56，另外兩種樣品加標(biāo)回收試驗的平均加標(biāo)回收率(%)=98.6％，說明樣品測定與標(biāo)準(zhǔn)品糖液高度一致。因此利用酶標(biāo)儀的免疫比色法延續(xù)了免疫比濁法準(zhǔn)確