低分子量亨氏馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯的制備及抗腫瘤活性研究.pdf

1、亨氏馬尾藻(Sargassum henslowianum C.Agardh)隸屬褐藻門,墨角藻目,馬尾藻科,馬尾藻屬。巖藻聚糖硫酸酯(Fuciodan)是海藻多糖中一類獨(dú)特的結(jié)合有硫酸基團(tuán)的活性多糖,具有顯著的抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗凝血及提高機(jī)體免疫力等作用。但由于其分子量大,溶解性較差,不容易被人體吸收,所以在研究和應(yīng)用方面受到了限制。酶降解是一種溫和的制備低分子量的活性海藻多糖的方法,但是市售的酶制劑價(jià)格昂貴,降解效果不佳,因此尋

2、找更經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的酶制劑值得進(jìn)一步的研究。
　　 本文以廣東湛江硇洲島的亨氏馬尾藻為原料,對(duì)已初步分離純化的亨氏馬尾藻巖藻聚糖(SF)再進(jìn)行分離純化,并以新鮮的海洋小雜魚內(nèi)臟為原料來提取降解海藻多糖粗酶,再以酶法降解大分子量的亨氏馬尾藻巖藻聚糖,并對(duì)降解前后亨氏馬尾藻巖藻聚糖的抗腫瘤活性與分子量、理化組成的關(guān)系展開了研究。
　　 本文首先以八種新鮮海洋小雜魚的肝胰臟為原料,比較得出從沙鉆魚肝胰臟提取出活力較高的酶。以磷酸鹽緩

3、沖液為浸提液,在單因素的基礎(chǔ)上通過L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)浸提工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)結(jié)果得出最佳的浸提條件為:浸提pH6.0、浸提溫度35℃、浸提時(shí)間3 h。再對(duì)粗酶液進(jìn)行分步鹽析沉淀,先以飽和度30％的硫酸銨除去部分雜質(zhì),離心收集上清液進(jìn)行硫酸銨鹽析沉淀。在單因素的基礎(chǔ)上采用L9(34)正交試驗(yàn)對(duì)鹽析工藝條件硫酸銨飽和度、pH、溫度、時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,得出最佳的鹽析條件為:硫酸飽和度為80％、鹽析pH為5.5、鹽析溫度為45℃、鹽析時(shí)間為3

4、 h。將制備的酶進(jìn)行SephadexG-100柱層析,洗脫出D1、D2、D3三個(gè)蛋白組分,其中組分D2的酶活力最大,D1、D3幾乎沒有酶活力,收集組分D2冷凍干燥,低溫保存。
　　 通過凝膠過濾法(Gel Filtration,GF)對(duì)超聲波熱水提取并用纖維素陰離子交換樹脂(Cellulose DE-52)分離純化得到的亨氏馬尾藻巖藻聚糖再進(jìn)行分級(jí)純化,通過SepharoseCL-6B瓊脂凝膠柱柱層析得到4個(gè)組分:SF1、SF2

5、、SF3、SF4,經(jīng)鑒定均為分子量較均一的組分。凝膠過濾標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定4個(gè)組分的相對(duì)分子量分別為:851.13kDa,239.85kDa,102.34kDa,19.95kDa。采用酶法對(duì)4個(gè)組分進(jìn)行降解得到相應(yīng)的降解組分:SF1-R、SF2-R、SF3-R、SF4-R,通過L9(34)正交試驗(yàn)得出最優(yōu)酶降解條件組合為:底物濃度為0.6％、降解pH為5.0、降解溫度為45℃、降解時(shí)間為4 h。同樣采用凝膠過濾標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)得降解后的4個(gè)組分

6、的相對(duì)分子量分別為:53.74kDa,19.54kDa,9.27kDa,6.69kDa,對(duì)比降解前后的各多糖組分的相對(duì)分子量得出SF1、SF2、SF3、SF4降解倍數(shù)分別為:15.82,12.34,11.22,3.01。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)降解前后多糖組分進(jìn)行理化分析:得出SF1、SF1-R、SF2、SF2-R、SF3、SF3-R、SF4、SF4-R的總糖含量分別為:72.92％,70.15％,67.55％,65.46％,60.87％,59

7、.23％,56.81％,55.78％；L-巖藻糖含量分別為:38.82％,36.91％,34.12％,31.33％,30.19％,25.58％,26.86％,19.84％；糖醛酸含量分別為:4.14％,4.65％,6.37％,7.43％,8.35％,8.93％,9.72％,10.23％；硫酸基含量分別為:30.93％,33.63％,32.65％,35.87％,29.88％,30.44％,21.61％,20.85％。
　　 通過細(xì)

8、胞體外培養(yǎng)法,采用MTT比色法研究了八組分亨氏馬尾藻巖藻聚糖在5個(gè)質(zhì)量濃度(1mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL)下分別對(duì)小鼠肉瘤細(xì)胞S-180、人肺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞SMMC-7721作用24 h、48 h、72 h時(shí)細(xì)胞增殖的抑制情況,結(jié)果分析表明:不同濃度,不同時(shí)間,八組分亨氏馬尾藻巖藻聚糖對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的抑制作用不同,隨著亨氏馬尾藻巖藻聚糖質(zhì)量濃度的增加和作用時(shí)間延長(zhǎng),3種腫瘤細(xì)胞

9、的抑制作用分別呈現(xiàn)不斷增強(qiáng)趨勢(shì),呈現(xiàn)一定的劑量和時(shí)間的依賴效應(yīng)。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析了八組分亨氏馬尾藻巖藻聚糖對(duì)三種腫瘤細(xì)胞的抑制效果(P<0.05顯著,P<0.01極顯著),結(jié)果表明:在48 h～72 h組,SF1-R、SF2-R對(duì)三種腫瘤細(xì)胞增殖的抑制效果較各自降解前SF1、SF2的抑制效果有顯著性提高(P<0.05顯著,P<0.01極顯著)；在72 h組,降解后的SF3-R抑制效果較顯著于降解前的抑制效果(P<0.05顯著,P<0.01

10、極顯著)；在24 h～72 h組,降解后的SF4-R較降解前的抑制效果顯著性不明顯(P>0.05)。結(jié)果分析還表明,8組分多糖中SF2-R對(duì)S-180、A549細(xì)胞增殖的抑制效果顯著于其他組分,SF2-R對(duì)S-180、A549細(xì)胞作用72 h后的抑制率分別為:77.57％,61.06％；8組分多糖中SF1-R對(duì)SMMC-7721細(xì)胞增殖的抑制效果顯著于其余組分,作用72 h后抑制率達(dá)到62.47％。經(jīng)計(jì)算:SF1、SF1-R、SF2、S

11、F2-R、SF3、SF3-R、SF4、SF4-R對(duì)S-180作用72 h的IC50值分別為:7.11mg/mL、5.57mg/mL、6.61mg/mL、4.89mg/mL、9.91mg/mL、8.91mg/mL、14.66mg/mL、14.79mg/mL；對(duì)A549作用72 h的IC50值分別為:11.64mg/mL、9.86mg/mL、10.63 mg/mL、8.75mg/mL、14.37mg/mL、12.62mg/mL、18.71m