MiRNA-155介導(dǎo)Th17-Treg失衡致自身免疫性心肌炎機(jī)制研究.pdf

1、第一部分自身免疫性心肌炎小鼠miR-155和Th17/Treg表達(dá)研究
　　目的：檢測(cè)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎（EAM）小鼠 miRNA-155表達(dá)情況和Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)免疫反應(yīng)。
　　方法：建立BABL/C小鼠α肌球蛋白重鏈（MyHC-α）來(lái)源多肽誘導(dǎo)的EAM模型；觀察并比較各組小鼠心臟和脾臟外觀變化，測(cè)量并比較各組小鼠體重變化、心臟質(zhì)量/體重比率（HW/BW）、心臟質(zhì)量/脛骨長(zhǎng)度比值(HW/TL)和脾臟總淋巴細(xì)胞

2、數(shù)；HE染色檢測(cè)小鼠心臟組織病理改變；原位雜交檢測(cè)小鼠心肌組織miR-155表達(dá)情況；RT-PCR檢測(cè)小鼠心肌組織、外周血單個(gè)核細(xì)胞，脾臟淋巴細(xì)胞，脾臟CD4+T細(xì)胞的miR-155表達(dá)情況；Western blot和RT-PCR檢測(cè)小鼠心肌組織Th17相關(guān)細(xì)胞因子（RORγt、IL-6、IL-17A）表達(dá)情況；流式檢測(cè)小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的Th17細(xì)胞比例和Treg細(xì)胞比例，以及小鼠脾臟CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）比例；West

3、ern blot和RT-PCR檢測(cè)Th17相關(guān)細(xì)胞因子（RORγt、IL-17A、IL-21、IL-22）和Treg相關(guān)細(xì)胞因子（TGF-β、IL-10、IL-35）表達(dá)情況，以及CD11c+DC表達(dá)促Th17細(xì)胞分化炎癥因子（IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23）水平；磁珠分選 EAM小鼠和正常對(duì)照小鼠的CD4+CD25+foxp3+Treg細(xì)胞和CD4+CD25-效應(yīng)性T細(xì)胞體外進(jìn)行混合培養(yǎng)和交叉培養(yǎng)，檢測(cè)EAM模型小鼠Tr

4、eg細(xì)胞抑制功能。
　　結(jié)果：與健康對(duì)照組相比，EAM模型小鼠心肌組織、外周血單個(gè)核細(xì)胞，脾臟CD4+T細(xì)胞的miR-155表達(dá)明顯升高，并且免疫組化顯示，小鼠心肌組織表達(dá)的miR-155主要位于炎癥侵潤(rùn)部位，而未受損的心肌組織則miR-155表達(dá)不明顯；EAM模型小鼠心肌組織Th17相關(guān)細(xì)胞因子（RORγt、IL-6、IL-17A）表達(dá)明顯升高；EAM模型小鼠脾臟 CD4+T細(xì)胞的Th17細(xì)胞比例明顯升高，同時(shí) Th17相關(guān)細(xì)胞

5、因子（RORγt、IL-17A、IL-21、IL-22）表達(dá)明顯升高；EAM模型小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的Treg細(xì)胞比例相比對(duì)照組無(wú)明顯變化，但Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子（TGF-β、IL-10、IL-35）表達(dá)明顯升高；EAM模型小鼠脾臟CD11c+DCs比例升高，DC表達(dá)促Th17細(xì)胞分化炎癥因子（IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23）水平升高。CFSE標(biāo)記效應(yīng)性T細(xì)胞檢測(cè)Treg細(xì)胞抑制功能試驗(yàn)表明EAM模型小鼠脾臟來(lái)源的T

6、reg細(xì)胞抑制功能無(wú)明顯變化，但其CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)Treg細(xì)胞抑制作用的反應(yīng)敏感度明顯降低。
　　結(jié)論：EAM小鼠心肌組織及脾臟CD4+T細(xì)胞miR-155表達(dá)明顯升高，同時(shí)EAM小鼠存在明顯的Th17/Treg細(xì)胞失衡，一方面表現(xiàn)為增殖失衡，即CD4+T細(xì)胞的Th17細(xì)胞比例明顯升高，而 Treg細(xì)胞雖然也有增殖但其比例無(wú)明顯變化；另一方面表現(xiàn)為功能失衡，即Th17細(xì)胞對(duì)Treg細(xì)胞的抑制功能產(chǎn)生抵抗，而Treg細(xì)

7、胞的本身的抑制功能并無(wú)明顯變化；EAM小鼠體內(nèi)CD11c+DCs分泌促Th17細(xì)胞分化所需炎癥因子的水平明顯增加。
　　第二部分 MiR-155促進(jìn)自身免疫性心肌炎小鼠Th17細(xì)胞的分化和功能
　　目的：探索miR-155對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎（EAM）中Th17和Treg細(xì)胞分化及其功能的影響；研究體內(nèi)抑制miR-155對(duì)自身免疫性心肌炎的治療作用。
　　方法：建立 BALB/c小鼠 EAM模型。通過(guò)尾靜脈注射 m

8、iRNA-155抑制劑（antagomir-155）抑制小鼠體內(nèi)miR-155的表達(dá)，尾靜脈注射PBS作為抑制劑對(duì)照。動(dòng)物分組：對(duì)照組（尾靜脈注射 PBS），對(duì)照組（尾靜脈注射 antagomir-155），EAM模型組（尾靜脈注射PBS），EAM模型組（尾靜脈注射antagomir-155）。觀察并比較各組小鼠心臟外觀變化，測(cè)量并比較各組小鼠體重變化，心臟質(zhì)量/體重比率（HW/BW），心臟質(zhì)量/脛骨長(zhǎng)度比值(HW/TL)，脾臟總淋巴細(xì)

9、胞數(shù)；組織病理學(xué)檢查和心臟超聲檢查比較各組小鼠心肌炎程度及心臟形態(tài)功能變化；RT-PCR檢測(cè)各組小鼠心肌組織、PBMCs、脾臟淋巴細(xì)胞的miR-155表達(dá)情況；Western blot和RT-PCR檢測(cè)各組小鼠心肌組織Th17相關(guān)細(xì)胞因子（RORγt、IL-6、IL-17A）表達(dá)情況；免疫組化檢測(cè)EAM模型小鼠IL-17A表達(dá)情況；分離EAM模型小鼠心肌炎性細(xì)胞，流式檢測(cè)Th17細(xì)胞表達(dá)情況；流式檢測(cè)各組小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的Th17

10、細(xì)胞比例和Treg細(xì)胞比例，以及小鼠脾臟CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）比例；Western blot和RT-PCR檢測(cè)Th17相關(guān)細(xì)胞因子（RORγt、IL-17A、IL-21、IL-22）和Treg相關(guān)細(xì)胞因子（TGF-β、IL-10、IL-35）表達(dá)情況，以及 CD11c+DC表達(dá)促 Th17細(xì)胞分化炎癥因子（IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23）水平。分離兩組EAM模型小鼠脾臟細(xì)胞體外進(jìn)行MyHC-α614-629多肽特

11、異性增殖反應(yīng)，比較兩組小鼠來(lái)源CD4+T細(xì)胞增值狀況及分泌IL-17A細(xì)胞因子水平。
　　結(jié)果：與尾靜脈注射PBS的EAM模型組小鼠對(duì)比，antagomir-155處理的EAM模型小鼠具有以下變化：心肌組織、PBMCs、脾臟淋巴細(xì)胞的miRNA-155表達(dá)明顯降低；心肌炎癥侵潤(rùn)、壞死、纖維化明顯改善；體重減輕百分比，HW/BW、HW/TL及總淋巴細(xì)胞數(shù)明顯降低；心臟形態(tài)及功能明顯改善；心肌組織Th17細(xì)胞及其相關(guān)因子（RORγt、

12、IL-6、IL-17A）明顯減少；小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞的Th17細(xì)胞比例和Treg細(xì)胞比例，以及小鼠脾臟CD11c+DCs比例明顯減少；小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞Th17相關(guān)細(xì)胞因子（RORγt、IL-17A、IL-21、IL-22）和Treg相關(guān)細(xì)胞因子（TGF-β、IL-10、IL-35）表達(dá)明顯降低；小鼠脾臟CD11c+DC表達(dá)促Th17細(xì)胞分化炎癥因子（IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23）明顯減少。MyHC-α多肽特異性

13、增殖反應(yīng)顯示 antagomir-155處理的EAM模型小鼠來(lái)源 CD4+T細(xì)胞體外抗原特異性增殖反應(yīng)明顯降低，并且分泌IL-17A細(xì)胞比例也明顯降低。
　　結(jié)論：通過(guò)尾靜脈注射 miR-155抑制劑 antagomir-155可以特異性干預(yù)小鼠體內(nèi)miR-155的表達(dá)及其功能；體內(nèi)抑制miR-155對(duì)EAM小鼠起著明顯的心臟保護(hù)作用，說(shuō)明miR-155促進(jìn)EAM的發(fā)生發(fā)展；體內(nèi)抑制miR-155能夠明顯減弱EAM小鼠Th17細(xì)胞

14、的活化及其促炎效應(yīng)，說(shuō)明miR-155通過(guò)促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化和功能介導(dǎo)EAM小鼠Th17/Treg失衡；體內(nèi)抑制miR-155明顯降低了EAM小鼠CD11c+DCs的表達(dá)及其分泌Th17細(xì)胞極化因子的水平，說(shuō)明miR-155可通過(guò)促進(jìn)DCs的分化和分泌炎癥因子的功能間接促進(jìn)Th17細(xì)胞的表達(dá)。
　　第三部分體外研究miR-155對(duì)Th17細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的分化及功能的影響
　　目的：通過(guò)體外過(guò)表達(dá)或抑制 miRNA-15

15、5的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究 miR-155對(duì)Th17細(xì)胞和骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞（BMDCs）的分化及其功能的影響。
　　方法：磁珠分選健康BALB/C小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞，分別體外轉(zhuǎn)染miR-155類似物（agomir-155）、miR-155抑制劑（antagomir-155）和各自對(duì)照劑（agomir-NC和antagomir-NC），再進(jìn)行 Th17細(xì)胞分化培養(yǎng)。收集培養(yǎng)上清液 ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞IL-17A分泌情況；流

16、式檢測(cè)各組細(xì)胞 Th17細(xì)胞分化比例；RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-155、Th17細(xì)胞相關(guān)因子（IL-17A、RORγt、STAT3）及miR-155靶基因SOCS-1表達(dá)情況。分離健康 BALB/c小鼠骨髓細(xì)胞，體外刺激誘導(dǎo) BMDCs生成，轉(zhuǎn)染antagomir-155或antagomir-NC，LPS刺激成熟。收集培養(yǎng)上清液ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞促炎因子IL-6、IL-23、TNF-α和IL-1β分泌情況；流式檢測(cè)各組細(xì)胞表面

17、標(biāo)志MHCⅡ、CD86、CD11c表達(dá)情況；RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-155，促炎因子IL-6、IL-23、TNF-α和IL-1β，以及miR-155靶基因SOCS-1、PU.1、SHIP-1表達(dá)情況。
　　結(jié)果:過(guò)表達(dá)miR-155的CD4+T細(xì)胞體外分化Th17細(xì)胞比例、分泌IL-17A細(xì)胞因子、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RORγt及STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子表達(dá)都明顯增加，而miR-155靶基因SOCS-1表達(dá)則明顯降低；miR-155

18、表達(dá)受抑制的CD4+T細(xì)胞體外分化Th17細(xì)胞比例、分泌IL-17A細(xì)胞因子、關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子RORγt及STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子表達(dá)都明顯降低，而 miR-155靶基因 SOCS-1表達(dá)則明顯增加。 miR-155表達(dá)受抑制的BMDCs經(jīng)LPS刺激后其成熟表面標(biāo)志MHCⅡ、CD86、CD11c表達(dá)無(wú)明顯變化，而分泌炎因子 IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-23的功能則明顯降低，同時(shí) miR-155靶基因SOCS-1、PU.1、SHIP