環(huán)介導等溫擴增技術(shù)在轉(zhuǎn)基因成分篩選檢測方法中的研究.pdf

1、隨著基因工程與分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因生物的研發(fā)和商業(yè)化日益增多。與此同時，公眾對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性仍存憂慮。因此，轉(zhuǎn)基因生物的產(chǎn)業(yè)化過程中，轉(zhuǎn)基因成分檢測作為其中重要的技術(shù)支撐，對于轉(zhuǎn)基因生物的監(jiān)管尤為重要。同時，轉(zhuǎn)基因生物中的插入基因和基因修飾越來越復雜和多樣化，商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物數(shù)量也呈現(xiàn)出逐年遞增的趨勢，轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法逐漸向?qū)︶槍Χ喟袠诉M行的快速、精準、高通量的核酸檢測分析技術(shù)方向發(fā)展。
　　聚合酶鏈式反應（P

2、CR）技術(shù)及實時熒光定量PCR技術(shù)已成為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品常規(guī)的定性、定量檢測方法，但這些技術(shù)都需要對溫度循環(huán)高精度控制的專業(yè)儀器，并且檢測時間都比較長，這樣就極大限制了這些方法在快速檢測、田間實驗的推廣應用。與此同時，核酸恒溫擴增技術(shù)得到了不斷發(fā)展與更新，其中，環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種不需要精密儀器和繁瑣操作步驟的等溫擴增方法，此技術(shù)具有高特異性，高靈敏

3、度以及快速的特點，也因此在轉(zhuǎn)基因成分檢測方面得到了廣泛關(guān)注。
　　本研究側(cè)重轉(zhuǎn)基因成分快速篩選，根據(jù)八個常見轉(zhuǎn)基因元件（CaMV35S啟動子，F(xiàn)MV35S啟動子，bar，cry1Ac，CP4 epsps，pat，NptII和NOS終止子）的序列信息，設計特異性環(huán)介導等溫擴增引物，優(yōu)化LAMP反應體系，并通過在環(huán)介導等溫擴增反應產(chǎn)物中加入SYBR Green I（1000×）熒光染料，建立了可視化的環(huán)介導等溫擴增轉(zhuǎn)基因篩選體系。

4、r>　　實驗結(jié)果證明建立的八種轉(zhuǎn)基因元件特異性環(huán)介導等溫擴增檢測方法具有高特異性，并且靈敏度（檢測限LOD）全部達到10個拷貝的基因組DNA，與傳統(tǒng)定性PCR的檢測限相比，從整體上有了一定幅度的提高[81]，并且整個檢測過程所需要的時間僅為一個小時，通過肉眼觀察顏色的變化即可立即判斷出檢測結(jié)果，不再需要擴增后的電泳檢測。此外，對于來自上海出入境檢驗檢疫局的實際樣品，我們利用LAMP檢測的結(jié)果也與理論結(jié)果完全一致。所以環(huán)介導等溫擴增技術(shù)為