環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)檢測(cè)旋毛蟲(chóng)DNA的研究.pdf

1、旋毛蟲(chóng)病(Trichinellosis)是一種較為嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲(chóng)病，主要因宿主生食或半生食了含有旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)囊包的肉類引起。該病地理分布廣泛，在過(guò)去的兩個(gè)世紀(jì)里，全球許多地區(qū)有旋毛蟲(chóng)病暴發(fā)流行的報(bào)道，被稱為再度肆虐的感染性疾病。旋毛蟲(chóng)是組織內(nèi)寄生線蟲(chóng)，目前主要采用傳統(tǒng)病原學(xué)診斷方法，但肌肉活檢及尸體膈肌壓片鏡檢的相關(guān)調(diào)查數(shù)據(jù)較少，對(duì)各地人群旋毛蟲(chóng)病患病率的評(píng)估很困難。血清學(xué)檢查雖然可行，但有諸多不足，如價(jià)格較貴、抗體檢測(cè)存在窗口期、

2、與其他寄生蟲(chóng)病易發(fā)生交叉反應(yīng)等，往往需要做更昂貴的免疫印跡實(shí)驗(yàn)。目前核酸分子檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用日趨廣泛，隨著檢測(cè)成本的降低，檢測(cè)過(guò)程更加標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化，此類技術(shù)將越來(lái)越多地應(yīng)用于寄生蟲(chóng)病的早期診斷、現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查等各個(gè)方面。
　　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，簡(jiǎn)稱LAMP），是日本學(xué)者Notomi發(fā)明的一種體外核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，這種技術(shù)需要特殊設(shè)計(jì)的4～6

3、條引物來(lái)特異性識(shí)別目標(biāo)片段，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶作用下在很短的時(shí)間內(nèi)擴(kuò)增靶序列，同時(shí)產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂，可通過(guò)濁度的變化來(lái)直接判斷陰陽(yáng)性結(jié)果。因此具有特異、快速、高效、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)。
　　本論文將LAMP技術(shù)應(yīng)用于旋毛蟲(chóng)感染小鼠不同組織樣本中旋毛蟲(chóng)DNA的快速檢測(cè)，研發(fā)了旋毛蟲(chóng)LAMP快速檢測(cè)試劑盒，使其更適宜于現(xiàn)場(chǎng)和基層醫(yī)療單位的旋毛蟲(chóng)快速檢測(cè)。以前的研究表明，PCR法檢測(cè)血液中旋毛蟲(chóng)DNA具有一定的早期診斷價(jià)值。而本研

4、究過(guò)程中通過(guò)建立高、中、低3種不同劑量旋毛蟲(chóng)感染小鼠模型，收集感染早期階段的肌肉、血液、糞便樣本進(jìn)行LAMP檢測(cè)，驗(yàn)證了該方法的高度敏感性和特異性，特別是對(duì)于肌肉中幼蟲(chóng)密度非常低時(shí)，該技術(shù)更突顯其重要的檢測(cè)和診斷價(jià)值。本論文研究證明LAMP法比PCR法更敏感、快速、簡(jiǎn)便，有望在提高人及動(dòng)物旋毛蟲(chóng)病的早期診斷，旋毛蟲(chóng)病的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、肉類檢疫及流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域發(fā)揮更大作用。
　　材料和方法：
　　1旋毛蟲(chóng)蟲(chóng)種、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、基因組D

5、NA的提取
　　本實(shí)驗(yàn)所用的蟲(chóng)種，旋毛蟲(chóng)河南豬源株（Trichinella spiralis，T1），北方旋毛蟲(chóng)(T.nativa，T2)、偽旋毛蟲(chóng)（T.pseudospiralis，T4）、南方旋毛蟲(chóng)(納氏旋毛蟲(chóng)，T.nelsoni，T7)，來(lái)自國(guó)際旋毛蟲(chóng)參考中心(International Trichinella Reference Centre，ITRC)本實(shí)驗(yàn)室昆明小鼠傳代保種。其他人體寄生蠕蟲(chóng)標(biāo)本，包括似蚓蛔線蟲(chóng)、蟯蟲(chóng)、

6、鞭蟲(chóng)、十二指腸鉤口線蟲(chóng)、華支睪吸蟲(chóng)、布氏姜片蟲(chóng)、日本血蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)、牛帶絳蟲(chóng)、曼氏迭宮絳蟲(chóng)，均由本實(shí)驗(yàn)室保存。6w齡健康雄性昆明小鼠(SPF級(jí))，體重20g～25g，購(gòu)買并飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。旋毛蟲(chóng)及其他樣本基因組DNA的提取采用天根公司的血液/組織/糞便基因組DNA提取試劑盒。
　　2 LAMP引物設(shè)計(jì)及最佳引物篩選
　　靶基因?yàn)镹CBI GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov

7、)上公開(kāi)的旋毛蟲(chóng)1.6kb重復(fù)DNA序列(GenBank:X06625.1)，將其Blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)特異性比對(duì)。選用Primer Explorer V4設(shè)計(jì)軟件(EIKEN CHEMICAL CO.，LTD，Tochigi，Japan)設(shè)計(jì)引物（http://primerexplorer.jp/e/），共設(shè)計(jì)出16套引物，以旋毛蟲(chóng)的基因組DNA為模板，在相同的條件下進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，

8、篩選最佳引物。
　　3 LAMP法檢測(cè)旋毛蟲(chóng)特異性評(píng)價(jià)
　　以旋毛蟲(chóng)(T1)、鄉(xiāng)土旋毛蟲(chóng)(T2)、偽旋毛蟲(chóng)(T4)、納氏旋毛蟲(chóng)(T7)基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，雙蒸水為陰性對(duì)照，其他10種人體寄生蟲(chóng)（似蚓蛔線蟲(chóng)、鞭蟲(chóng)、蟯蟲(chóng)、十二指腸鉤口線蟲(chóng)、布氏姜片蟲(chóng)、華支睪吸蟲(chóng)、日本血吸蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)、牛帶絳蟲(chóng)、曼氏迭宮絳蟲(chóng)）的基因組DNA為特異性對(duì)照進(jìn)行LAMP反應(yīng)，用實(shí)時(shí)濁度儀和鈣黃綠素顏色反應(yīng)兩種方法檢測(cè)結(jié)果。
　　4 LAMP

9、法檢測(cè)旋毛蟲(chóng)核酸濃度的敏感性及與PCR法的比較
　　為驗(yàn)證篩選出的最佳引物的敏感性，并與PCR法的敏感性相比較，提取100條旋毛蟲(chóng)肌肉幼蟲(chóng)基因組DNA，經(jīng)核酸定量后以10倍梯度進(jìn)行稀釋，DNA的濃度范圍為3，620 ng/μl至3.62 fg/μl，每個(gè)LAMP反應(yīng)中加入2μl的DNA模板，LAMP法進(jìn)行敏感性評(píng)價(jià)。同時(shí)以TS2F3和TS2B3為引物，以相同濃度的旋毛蟲(chóng)DNA為模板，PCR法進(jìn)行敏感性評(píng)價(jià)。
　　5 LAMP

10、法檢測(cè)單條旋毛蟲(chóng)幼蟲(chóng)的敏感性及與PCR法的比較
　　提取10條旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)基因組DNA，定容于1ml的PBS溶液中，以10倍梯度稀釋，使?jié)舛确秶喈?dāng)于每1ml PBS溶液中含10～0.00001條幼蟲(chóng)DNA，每個(gè)LAMP反應(yīng)中加入2μl的DNA模板。用LAMP法和PCR法進(jìn)行敏感性評(píng)價(jià)。
　　6旋毛蟲(chóng)不同模擬樣本核酸提取方法的比較
　　評(píng)價(jià)DNA提取試劑盒和Chelex法提取旋毛蟲(chóng)肌肉、血液、糞便模擬樣本基因組DNA的

11、效果。分別將1條旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)加入50μl健康小鼠血液，200mg健康小鼠糞便，250mg健康小鼠肌肉組織，分別用天根公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒和Chelex裂解液提取基因組DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)，評(píng)價(jià)兩種方法提取的單條旋毛蟲(chóng)DNA模板的擴(kuò)增效率。
　　7評(píng)價(jià)封閉劑對(duì)LAMP反應(yīng)和鈣黃綠素顯色效果的影響
　　檢測(cè)封閉劑是否影響LAMP反應(yīng)及鈣黃綠素的顯色效果，將熔點(diǎn)為42℃的精煉固態(tài)石蠟融化后導(dǎo)入模具，制成直

12、徑與反應(yīng)管相同的柱狀固態(tài)石蠟塊，設(shè)計(jì)6組對(duì)照實(shí)驗(yàn)比較添加或不添加石蠟及鈣黃綠素對(duì)LAMP反應(yīng)的影響。
　　8 LAMP試劑盒檢測(cè)小鼠肌肉中旋毛蟲(chóng)DNA
　　(1)將10條旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)加入1g健康小鼠肌肉組織，充分研磨后提取基因組DNA，以10倍梯度進(jìn)行稀釋，使?jié)舛确秶喈?dāng)于每1g肌肉組織中含10～0.00001條幼蟲(chóng)，每個(gè)反應(yīng)加入2μl的DNA模板，用LAMP法和PCR法評(píng)價(jià)肌肉模擬樣本的敏感性。
　　(2)6w齡健康

13、雄性昆明小鼠18只，隨機(jī)分成3組，每組6只，用灌胃法感染旋毛蟲(chóng)。組Ⅰ:陰性對(duì)照組;組Ⅱ:每只小鼠感染10條肌幼蟲(chóng);組Ⅲ:每只小鼠感染50條肌幼蟲(chóng);LAMP法檢測(cè)感染后第20d的小鼠肌肉樣本。
　　9 LAMP試劑盒檢測(cè)小鼠血液中旋毛蟲(chóng)DNA
　　6w齡健康雄性昆明小鼠15只，隨機(jī)分成3組，每組5只，用灌胃法感染旋毛蟲(chóng)。每組小鼠分別感染10條、100條、300條肌肉幼蟲(chóng)，建立低、中、高度感染小鼠動(dòng)物模型。感染后第1d～20d每

14、天采集每只小鼠尾靜脈血50μl，每天5個(gè)血液樣本，共300個(gè)樣本提取基因組DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)。
　　10 LAMP試劑盒檢測(cè)小鼠糞便中旋毛蟲(chóng)DNA
　　6w齡健康雄性昆明小鼠15只，隨機(jī)分成3組，每組5只，用灌胃法感染旋毛蟲(chóng)。每組小鼠分別感染10條、100條、300條肌幼蟲(chóng)，感染后第1d～20d每組小鼠每天采集糞便樣本，分成4份樣本，共240個(gè)樣本提取基因組DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)。
　　11統(tǒng)計(jì)分析
　　使用

15、軟件SPSS17.0對(duì)血液、糞便樣本的LAMP檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水平為α=0.05。
　　結(jié)果：
　　1最佳引物篩選
　　通過(guò)對(duì)靶序列Blast比對(duì)，旋毛蟲(chóng)1.6kb DNA重復(fù)序列具有很好的特異性，根據(jù)該序列共設(shè)計(jì)了16套引物，在相同的條件下進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，15套可以擴(kuò)增出靶基因，尤其添加了環(huán)引物后擴(kuò)增效率提高了1/3，其中TS2套引物最先發(fā)生LAMP反應(yīng)，且擴(kuò)增效率最高，作為最佳引物進(jìn)行下一步的實(shí)

16、驗(yàn)。
　　2特異性實(shí)驗(yàn)
　　只有陽(yáng)性對(duì)照組旋毛蟲(chóng)(T1)、鄉(xiāng)土旋毛蟲(chóng)(T2)、偽旋毛蟲(chóng)(T4)、納氏旋毛蟲(chóng)(T7)的基因組DNA作為模板時(shí)發(fā)生LAMP擴(kuò)增，而陰性對(duì)照組其他10余種人體寄生蠕蟲(chóng)的基因組DNA和水作為模板時(shí)均沒(méi)有發(fā)生擴(kuò)增。實(shí)時(shí)濁度儀和鈣黃綠素顏色反應(yīng)兩種方法檢測(cè)結(jié)果一致，實(shí)驗(yàn)說(shuō)明TS2套引物具有很好的屬特異性。
　　3 LAMP法檢測(cè)旋毛蟲(chóng)核酸濃度的敏感性及與PCR法的比較
　　LAMP法可檢測(cè)到D

17、NA的最低濃度為362 fg/μl，以TS2F3和TS2B3為引物，PCR反應(yīng)產(chǎn)物是225bp大小的擴(kuò)增條帶，經(jīng)測(cè)序?yàn)槟康钠巍CR法檢測(cè)到的最低濃度為3.62 pg/μl，因此LAMP法比PCR法的敏感性高出10倍以上。
　　4 LAMP法檢測(cè)單條旋毛蟲(chóng)的敏感性及與PCR法的比較
　　LAMP法檢測(cè)單條旋毛蟲(chóng)肌幼蟲(chóng)的靈敏性為0.001條/ml，PCR法的靈敏性為0.01條/ml，驗(yàn)證了LAMP法比PCR法敏感性高出10倍

18、以上結(jié)論。
　　5旋毛蟲(chóng)樣本不同核酸提取方法的比較
　　用天根公司的血液/組織/糞便基因組DNA提取試劑盒和Chelex裂解液提取含1條幼蟲(chóng)的血液、糞便、肌肉模擬樣本DNA，經(jīng)LAMP檢測(cè)均為陽(yáng)性，兩種方法提取的DNA模板的擴(kuò)增效率差異不顯著。
　　6評(píng)價(jià)封閉劑的影響
　　加封閉劑組與不加封閉劑組的LAMP檢出時(shí)間不變，顯示封閉劑不抑制LAMP擴(kuò)增效率;加鈣黃綠素組的封閉劑對(duì)LAMP檢出時(shí)間不變，顯示封閉劑不抑制

19、添加了鈣黃綠素的LAMP擴(kuò)增效率。
　　7 LAMP試劑盒檢測(cè)小鼠肌肉中旋毛蟲(chóng)DNA
　　(1) LAMP法檢測(cè)每克肌肉組織含10條幼蟲(chóng)的DNA，最低可檢測(cè)到0.01條/g， PCR法為0.1條/g，可見(jiàn)LAMP法比PCR法的敏感性高出10倍以上。
　　(2)分別感染10條、50條肌幼蟲(chóng)組第20d的小鼠肌肉樣本，2組LAMP檢測(cè)均為陽(yáng)性結(jié)果，檢出率為100％(6/6)，未感染組小鼠肌肉樣本均為陰性結(jié)果。
　　8

20、LAMP試劑盒檢測(cè)小鼠血液中旋毛蟲(chóng)DNA
　　(1)為L(zhǎng)AMP檢測(cè)小鼠輕度感染（10條幼蟲(chóng)）組1d～20dpi的血液樣本，每天5份樣本，共100份樣本，最早于第9dpi的樣本中檢測(cè)到旋毛蟲(chóng)特異DNA，第9d、10d、13d、18d～20dpi每天的陽(yáng)性率為20％(1/5);第15d、17dpi每天的陽(yáng)性率為40％(2/5)。
　　(2) LAMP檢測(cè)小鼠中度感染（100條幼蟲(chóng)）組1d～20dpi的血液樣本，每天5份樣本，共1

21、00份樣本，最早于第1dpi的樣本中檢測(cè)到旋毛蟲(chóng)特異DNA，第1d、3d、1id、12d、15dpi每天的陽(yáng)性率為20％(1/5);第7d、8d、10d、17d、19d、20dpi每天的陽(yáng)性率為40％(2/5)。
　　(3) LAMP檢測(cè)小鼠重度感染（300條幼蟲(chóng)）組1d～20dpi的血液樣本，每天5份樣本，共100份樣本，最早于第3dpi的樣本中檢測(cè)到旋毛蟲(chóng)特異DNA，第4d、5d、9d、13d、14d、16d、20dpi每天的

22、陽(yáng)性率為20％(1/5)，第3dpi的陽(yáng)性率為40％(2/5)，第8d、10d、11d、19dpi的陽(yáng)性率為60％(3/5)，第15dpi的陽(yáng)性率為80％(4/5)。
　　(4)3組不同感染度小鼠LAMP陽(yáng)性率間的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=4.899，P=0.086），LAMP檢測(cè)血液樣本的陽(yáng)性率與感染程度沒(méi)有相關(guān)性。輕度感染小鼠不同天數(shù)間的LAMP檢測(cè)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=20.000，P=0.395);中度感染小鼠不同

23、天數(shù)間的LAMP陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=23.459，P=0.218);高度感染小鼠不同天數(shù)間的LAMP陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=31.393，P=0.037)。當(dāng)輕度感染時(shí)LAMP檢測(cè)陽(yáng)性率與檢測(cè)時(shí)間沒(méi)有相關(guān)性，當(dāng)重度感染時(shí)LAMP檢測(cè)陽(yáng)性率與檢測(cè)時(shí)間有一定的相關(guān)性，第8d～15dpi檢出率較高。
　　9 LAMP試劑盒檢測(cè)小鼠糞便中旋毛蟲(chóng)DNA
　　(1) LAMP檢測(cè)小鼠輕度感染組（10條幼蟲(chóng)）第1d～20d

24、pi的糞便樣本，每天4個(gè)樣本，共80份樣本，最早于第6dpi的樣本中檢測(cè)到旋毛蟲(chóng)特異DNA，分別在第6～11d、13～19dpi的糞便樣本中檢測(cè)出陽(yáng)性樣本;其中第6～10d、13～15d、17dpi每天的陽(yáng)性率為25％(1/4)，第1id、18d、19dpi每天的陽(yáng)性率為50％(2/4)。
　　(2) LAMP檢測(cè)小鼠中度感染（100條幼蟲(chóng)）組1d～20dpi的糞便樣本，每天4個(gè)樣本，共80個(gè)樣本，最早于第2dpi的樣本中檢測(cè)到旋

25、毛蟲(chóng)特異DNA，分別在第2、4、5、7d、9～20dpi的糞便樣本中檢測(cè)出陽(yáng)性樣本;其中第2d、4d、9d、1id、19d、20dpi每天的陽(yáng)性率為25％(1/4)，第10d、14d、18dpi每天的陽(yáng)性率為50％(2/4)，第5d、7d、12d、13d、15～17dpi每天的陽(yáng)性率為75％(3/4)。
　　(3) LAMP檢測(cè)小鼠重度感染（300條幼蟲(chóng)）組1d～20dpi的糞便樣本，每天4個(gè)樣本，共80個(gè)樣本，最早于第2dpi的

26、樣本中檢測(cè)到旋毛蟲(chóng)特異DNA，分別在第2～20dpi的糞便樣本中檢測(cè)出陽(yáng)性樣本;其中第2d、3d、6d、9d、18dpi每天的陽(yáng)性率為25％(1/4)，第5d、14d、19dpi每天的陽(yáng)性率為50％(2/4)，第4d、7d、8d、10d、13d、15d、16d、20dpi每天的陽(yáng)性率為75％(3/4)，第1id、12d、17dpi每天的陽(yáng)性率為100％(4/4)。
　　(4)3組小鼠LAMP陽(yáng)性率間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=14

27、.823，P=0.001)，陽(yáng)性率與感染劑量有相關(guān)性（rs=0.500，P＜0.001），陽(yáng)性率隨感染劑量的增加而升高（F=20.492，P＜0.001）。輕度感染組不同天數(shù)間的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=15.761，P=0.673);中度感染組不同天數(shù)間的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=27.389，P=0.096);重度感染組不同天數(shù)間的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=27.389，P=0.096)。可以看出LAMP檢測(cè)糞便樣本的陽(yáng)

28、性率與感染后檢測(cè)時(shí)間沒(méi)有相關(guān)性。
　　結(jié)論：
　　1.本論文發(fā)明的旋毛蟲(chóng)LAMP快速檢測(cè)試劑盒，可在60min內(nèi)完成反應(yīng)。具有良好的敏感性和特異性。有望應(yīng)用于旋毛蟲(chóng)病的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、肉類檢疫及流行病學(xué)調(diào)查等領(lǐng)域。
　　2.應(yīng)用該試劑盒，對(duì)不同劑量旋毛蟲(chóng)感染小鼠早期階段的肌肉、血液、糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)，可以在低劑量感染小鼠的早期各種來(lái)源的樣本中檢測(cè)到旋毛蟲(chóng)DNA，具有較高的檢出率。
　　3.LAMP試劑盒檢測(cè)旋毛蟲(chóng)小鼠血