殼聚糖酶產生菌的篩選、鑒定、發(fā)酵條件及其應用研究.pdf

1、殼聚糖酶(chitosanase，EC3.2.1.132)能專一性催化水解殼聚糖為殼寡糖，在酶法制備殼寡糖中有較高的應用潛力。殼聚糖酶主要存在于細菌、真菌等微生物的細胞中，在單子葉及雙子葉植物的不同組織中也有該酶的活性。目前，有關殼聚糖酶的研究主要基于微生物，但其酶活力都相對較低，這極大限制了其應用。本課題就這一問題，針對產殼聚糖酶菌株的分離篩選、殼聚糖酶高產菌株的選育、菌種鑒定、最佳產酶條件以及殼寡糖的酶法制備及其對致病菌的抑制作用進

2、行了以下研究。
　　 (1)殼聚糖酶高產菌株的分離篩選。采集蝦蟹殼常年堆積的土壤樣品，以粉末殼聚糖為唯一碳源，利用透明圈法根據菌株產生的透明圈與菌落直徑的比值(D/d)對產殼聚糖酶高產菌株進行初步篩選，再經搖瓶發(fā)酵復篩得到了三株優(yōu)勢菌株，再結合三株菌的持續(xù)酶活力測定曲線，最終確定了H2為最佳殼聚糖酶產生菌株，其D/d值及相應酶活力分別為4.5±0.5和0.61±0.005U/mL。
　　 (2)對殼聚糖酶高產菌株H2進行

3、分類鑒定。根據形態(tài)特征、生理生化特性及16SrDNA序列分析，參照《伯杰細菌分類手冊》和《鏈霉菌鑒定手冊》，最終鑒定該菌株為淺玫瑰色鏈霉菌，命名為StreptomycesroseolusDH。
　　 (3)高產殼聚糖酶的發(fā)酵條件的研究。為提高酶的產量，對高產殼聚糖酶菌株DH進行發(fā)酵條件研究。主要針對菌株DH進行培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進行單因素研究。隨后進行了發(fā)酵條件的優(yōu)化，由單因素試驗確定了溫度、初始pH、發(fā)酵時間為三個顯著性因子

4、，作為響應曲面法優(yōu)化的因素。借助DesignExpert7.0統計軟件分析并獲得最佳響應值，得到最優(yōu)發(fā)酵條件。
　　 綜合單因素實驗及上述發(fā)酵條件優(yōu)化結果，最終確定一個最佳的產酶條件，其培養(yǎng)基成分(W/V)為：酵母提取物0.5，K2HPO40.07，KH2PO40.03，NaCl0.5，MgSO4·7H2O0.05，1％的膠體殼聚糖，0.5％的蛋白胨，培養(yǎng)條件為：初始pH7.2，溫度30℃、搖床轉速150rpm、裝液量100mL

5、/250mL，接種量2％，發(fā)酵時間62.5h。優(yōu)化后DH菌株產酶酶活力由6.10±0.12U/mL提高到6.94±0.29U/mL，即提高了13％。
　　 (4)發(fā)酵粗酶液的性質及產物殼寡糖的抑菌活性的初步研究。在研究發(fā)酵條件溫度、初始pH的同時，對酶解條件進行了具體的研究和分析，最終確定出最佳的酶解反應體系為酶解溫度為45℃、反應時間為30min、反應pH為5.6。
　　 利用DH菌株的發(fā)酵液對膠體殼聚糖進行降解，成功

6、制得一定純度的粉末殼寡糖，其水溶性很好，與市售寡糖有較高的相似性。然后，測定出了自制殼寡糖的脫乙酰度94.41％和聚合度4，這些對其活性有較大的影響，尤其是在抑菌活性方面。
　　 初步探討了濃度為0.5％的自制殼寡糖溶液對致病菌的抑制作用。結果表明，自制殼寡糖對大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、副溶血弧菌(Vibr