大腸桿菌中酸脅迫及狀態(tài)自切換的研究.pdf

1、大腸桿菌（Escherichia coli）作為模式生物雖已廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)，但大腸桿菌對無機(jī)酸和有機(jī)酸的耐受性還有待提高，發(fā)酵過程中若產(chǎn)物不能及時分離出去，酸的累積可能會對菌體造成抑制。迄今對大腸桿菌耐酸的研究仍很欠缺，需要用合適的基因工程、代謝工程手段篩選合適的耐酸基因，提高大腸桿菌發(fā)酵法產(chǎn)酸的產(chǎn)量。本文對大腸桿菌進(jìn)行了一系列代謝工程改造，探索了其耐酸機(jī)制;及雙質(zhì)粒情況下，提高菌體的生長和生產(chǎn)能力;并基于群體感應(yīng)原理建立了狀態(tài)自動切

2、換模型。主要工作如下:
　　1、對已報道的革蘭氏陰性菌和陽性菌中與耐酸相關(guān)的基因，在丙酸脅迫下在大腸桿菌中進(jìn)行耐酸能力的研究。篩選得到過表達(dá)編碼磷酸葡萄異構(gòu)酶基因的E.coli BL21(pET-pgi)和編碼RNA集合酶σ因子基因的E.coli BL21(pET-rpoS)能夠在丙酸濃度為0.4 g/L的酸性平板上生長;提高丙酸濃度至0.5 g/L，E.coli BL21(pET-rpoS)能夠存活，發(fā)酵結(jié)果顯示E.coliBL

3、21(pET-rpoS)的菌體濃度在平穩(wěn)期基本與野生菌保持一致。丙酸對E.coli BL21(pET-rpoS)的最小抑菌濃度為7.8125 mg/mL，是野生菌的2倍。該結(jié)果證明pgi和rpoS的表達(dá)提高了大腸桿菌酸耐受的能力。
　　2、費氏弧菌（Vibrio fischeri）群體感應(yīng)關(guān)鍵基因luxI和luxR，前者誘導(dǎo)信號分子AHL的合成，后者編碼的蛋白質(zhì)LuxR可與AHL結(jié)合從而誘導(dǎo)啟動子PluxI開啟轉(zhuǎn)錄，AHL可分泌到

4、胞外并在胞間擔(dān)任信號分子，也可進(jìn)入其他細(xì)胞促使啟動子PluxI的轉(zhuǎn)錄。構(gòu)建產(chǎn)乳酸載體pET-PluxI-ldhA和群體感應(yīng)載體pUC-luxI-luxR，共轉(zhuǎn)化缺失乳酸脫氫酶的突變菌E.coliBL21ΔldhA。發(fā)酵結(jié)果表明，E.coli BL21ΔldhA的乳酸最高產(chǎn)量比野生菌減少了43.4％。重組菌E.coli BL21(pET-PluxI-ldhA+pUC-luxI-luxR)的乳酸產(chǎn)量在菌體密度最高時達(dá)到最大值1.233 g/

5、L，是對照菌的1.72倍。實驗結(jié)果表明，在不添加誘導(dǎo)劑的情況下，群體感應(yīng)可實現(xiàn)菌體從生長到生產(chǎn)的自動切換。
　　3、為提高雙質(zhì)粒系統(tǒng)下大腸桿菌的生長，構(gòu)建了兩個載體分別表達(dá):(1)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC);(2)與NAD+合成相關(guān)的關(guān)鍵酶:煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶(pncB)、煙酸單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶（nadD）和NAD+合成酶（nadE）。將這兩個載體共轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得重組菌E.coli BL21(pET-pepc+pUC